甲氧化三丁基錫多終點(diǎn)遺傳毒性評(píng)價(jià)和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制研究.pdf

1、有機(jī)錫(Organotin)可強(qiáng)烈地殺滅真菌、蟲體以及軟體動(dòng)物，自20世紀(jì)60年代開始作為涂料添加劑廣泛用于防止海洋附著生物對(duì)船體、魚網(wǎng)、鉆井平臺(tái)等的污損。三丁基錫(Tributyltin，TBT)是其中應(yīng)用最多、效果最強(qiáng)的一類。然而由于其不斷釋放入周圍水體并沉降入海泥中，對(duì)其它非目標(biāo)性生物也產(chǎn)生了嚴(yán)重的生態(tài)環(huán)境危害。三丁基錫還是一種內(nèi)分泌干擾物，可導(dǎo)致貝類畸形、牡蠣發(fā)育異常、腹足類動(dòng)物性畸變(Imposex)。三丁基錫不僅對(duì)水生生物造

2、成危害，而且可以通過食物鏈危害人類。有機(jī)錫對(duì)海洋的污染及其對(duì)海洋生物的毒性受到各國(guó)的關(guān)注，并被認(rèn)為是迄今為止由人為因素而導(dǎo)致大量進(jìn)入海水環(huán)境的毒性最大的化學(xué)品之一，許多國(guó)家政府紛紛采取措施限制和禁止有機(jī)錫在海洋中的使用，目前已被聯(lián)合國(guó)環(huán)境保護(hù)署歸入持久性有毒物質(zhì)(Persistenttoxicsubstances，PTS)之一，國(guó)際海事組織已經(jīng)規(guī)定2008年后停止使用。盡管人們可以減少三丁基錫從涂料中的釋放量，但是三丁基錫能夠在海泥中高

3、濃度地保留許多年，尤其是在一些海灣地區(qū)。 對(duì)三丁基錫的研究報(bào)道多是關(guān)于免疫毒性和內(nèi)分泌干擾作用的研究，對(duì)三丁基錫的遺傳毒性以及毒作用機(jī)制的研究報(bào)道很少，而且多是關(guān)于水生生物。有研究者以貽貝(Mytilusedulis)和沙蟲(Platynereisdumerilli)兩種腹足軟體動(dòng)物為實(shí)驗(yàn)材料對(duì)三丁基錫進(jìn)行了姐妹染色體交換試驗(yàn)、染色體畸變?cè)囼?yàn)、彗星電泳試驗(yàn)及微核試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)其具有遺傳毒性，但誘導(dǎo)遺傳毒性的劑量與存活率的劑量非常接近

4、，因此亟待采用其它種類的生物進(jìn)行遺傳毒性的研究。 每種遺傳毒性評(píng)價(jià)試驗(yàn)都能反映特定的遺傳學(xué)終點(diǎn)。但任何試驗(yàn)都不能反映全部的遺傳學(xué)終點(diǎn)，因此，對(duì)化合物的遺傳毒性評(píng)價(jià)需要進(jìn)行試驗(yàn)配套，即采用遺傳學(xué)終點(diǎn)相互互補(bǔ)的試驗(yàn)進(jìn)行聯(lián)合評(píng)價(jià)和研究。在配套試驗(yàn)中，應(yīng)包括體內(nèi)試驗(yàn)(invivo)和體外試驗(yàn)(invitro)、真核細(xì)胞試驗(yàn)和原核細(xì)胞試驗(yàn)。因此，為對(duì)三丁基錫進(jìn)行較系統(tǒng)的遺傳毒性評(píng)價(jià)，本研究以甲氧化三丁基錫(Tributyltin，TBTM

5、O)為對(duì)象、采用了包括哺乳動(dòng)物在內(nèi)的、多遺傳學(xué)終點(diǎn)的配套試驗(yàn)對(duì)三丁基錫的遺傳毒性進(jìn)行了評(píng)價(jià)，內(nèi)容包括：小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核試驗(yàn)、小鼠精子畸形試驗(yàn)、鼠傷寒沙門氏菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn)(Ames試驗(yàn))、小鼠脾淋巴細(xì)胞hprt基因突變?cè)囼?yàn)、CHL細(xì)胞染色體畸變?cè)囼?yàn)，并對(duì)急性毒性進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)研究。 細(xì)胞凋亡也稱細(xì)胞程序性死亡(Programmedcelldeath，PCD)，是細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞外的誘導(dǎo)因子所誘導(dǎo)的一種細(xì)胞主動(dòng)“自殺”過程，也是化合

6、物發(fā)揮細(xì)胞毒性的重要分子機(jī)制。有研究表明，三丁基錫對(duì)細(xì)胞和生物體均表現(xiàn)出強(qiáng)烈的毒性，并可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。然而，凋亡過程中涉及復(fù)雜的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)因子和效應(yīng)蛋白，并具有嚴(yán)格的時(shí)序控制性。不同的凋亡誘導(dǎo)因子可以通過不同的途徑和機(jī)制誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。至今三丁基錫誘導(dǎo)凋亡的機(jī)制仍未完全確定。為此，本研究以人Jurkat淋巴瘤細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)材料，對(duì)甲氧化三丁基錫誘導(dǎo)的磷脂酰絲氨酸的翻轉(zhuǎn)、第二信號(hào)因子胞內(nèi)鈣離子的變化、是否通過線粒體途徑(檢測(cè)線粒體膜蛋白Apo2.

7、7、線粒體膜電位(△ψm))、是否依賴于凋亡的重要效應(yīng)器caspase-3和核DNA修復(fù)機(jī)制相關(guān)的PARP酶、細(xì)胞DNA斷裂分析、對(duì)細(xì)胞周期的影響、誘導(dǎo)凋亡發(fā)生的細(xì)胞周期時(shí)相等多個(gè)凋亡通路節(jié)點(diǎn)和相關(guān)因子進(jìn)行了研究。 小鼠淋巴細(xì)胞hprt基因突變分析試驗(yàn)是遺傳毒性評(píng)價(jià)的重要方法，其獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)在于不僅能檢測(cè)出突變劑的致突變能力大小，還可以進(jìn)一步檢測(cè)其分子突變譜。然而該試驗(yàn)是在96孔U型細(xì)胞培養(yǎng)板中完成，實(shí)驗(yàn)中需要在顯微鏡下觀察和記錄

8、細(xì)胞克隆，但是非染色狀態(tài)下細(xì)胞克隆在U型板中不易辨別。顯微鏡下人工判定是一項(xiàng)繁重而準(zhǔn)確性欠佳的工作。 近年來，轉(zhuǎn)基因動(dòng)物在環(huán)境致突變研究方面得到了迅速發(fā)展和應(yīng)用。究其原因，是因?yàn)檗D(zhuǎn)基因動(dòng)物結(jié)合了目前體內(nèi)外遺傳毒理試驗(yàn)的主要優(yōu)點(diǎn)。它既有一個(gè)明確的外源靶基因便于在動(dòng)物染毒后可從任一感興趣的特定靶器官或組織中分離和回收靶基因，并在體外進(jìn)行精確的分子突變譜分析(體外試驗(yàn)的優(yōu)點(diǎn))；同時(shí)，它又可以整體動(dòng)物染毒，能比較真實(shí)地反映誘變劑在體內(nèi)的

9、吸收、分布和代謝方面的特點(diǎn)(體內(nèi)試驗(yàn)的優(yōu)點(diǎn))，因此，轉(zhuǎn)基因動(dòng)物是目前研究體內(nèi)基因突變比較理想而且有效的工具。 GFP基因近年來廣泛應(yīng)用于細(xì)胞生物學(xué)，其表達(dá)產(chǎn)物GFP不需其它熒光素的標(biāo)記即可發(fā)射綠色熒光。理論上GFP轉(zhuǎn)基因動(dòng)物用于hprt基因突變?cè)囼?yàn)正好可以解決試驗(yàn)中細(xì)胞克隆不易觀察的技術(shù)問題，是hprt突變?cè)囼?yàn)的理想動(dòng)物模型。為了更好地應(yīng)用小鼠hprt突變?cè)囼?yàn)對(duì)三丁基錫進(jìn)行遺傳毒性評(píng)價(jià)，本文對(duì)GFP轉(zhuǎn)基因小鼠用作hprt基因突變

10、試驗(yàn)動(dòng)物模型進(jìn)行了初步研究。 本研究共包括三個(gè)部分。主要結(jié)果如下： 第一部分：GFP轉(zhuǎn)基因小鼠用作hprt基因突變?cè)囼?yàn)動(dòng)物模型的初步研究。 1.比較了GFP轉(zhuǎn)基因小鼠和普通小鼠的微孔培養(yǎng)物在顯微鏡下的觀察結(jié)果。結(jié)果顯示GFP轉(zhuǎn)基因小鼠的微孔培養(yǎng)物比普通小鼠易于確認(rèn)，結(jié)果準(zhǔn)確，前者優(yōu)于后者。 2.觀察了乙基亞硝基脲(ENU)誘導(dǎo)GFP轉(zhuǎn)基因小鼠和普通小鼠后的動(dòng)態(tài)外周血嗜多染紅細(xì)胞和骨髓嗜多染紅細(xì)胞的微核率變

11、化。染毒方法為劑量50mg/kg、100mg/kg，每天1次、腹腔注射方式。誘導(dǎo)后小鼠外周血微核率在第3天迅速上升，在6天達(dá)到高峰，此后迅速降低，第21天時(shí)微核率已降至本底值的水平。兩種小鼠的試驗(yàn)結(jié)果基本相同。 3.小鼠淋巴細(xì)胞刺激液的制備。結(jié)果顯示其刺激小鼠淋巴細(xì)胞的增殖是有效的。 4.設(shè)計(jì)了GFP轉(zhuǎn)基因小鼠的hprt基因的9個(gè)外顯子PCR引物和mRNA的2個(gè)RT-PCR引物，并對(duì)其基因組DNA和總mRNA進(jìn)行了驗(yàn)證性

12、檢測(cè)。結(jié)果顯示GFP轉(zhuǎn)基因小鼠的hprt基因是完整的，與其源系小鼠C57BL/6J相比未見有差異，提示這些引物序列設(shè)計(jì)是可行的，可進(jìn)一步應(yīng)用于GFP轉(zhuǎn)基因小鼠hprt基因突變檢測(cè)試驗(yàn)。 5.對(duì)ENU誘導(dǎo)后的突變模型進(jìn)行了突變分析：ENU50mg/kg、100mg/kg(每天1次，共5次)誘導(dǎo)后脾淋巴細(xì)胞克隆效率(PE)明顯下降，分別為8.6％和7.7％(對(duì)照組的PE為10.5％)，而hprt基因突變率(MF)顯著上升，分別為8.

13、2×10-6和11.4×10-6，分別是正常組的8.4倍和11.6倍。對(duì)6個(gè)突變克隆外顯子1的測(cè)序結(jié)果均未見異常，而3個(gè)突變克隆的外顯子9卻發(fā)現(xiàn)其中有2個(gè)發(fā)生了A:T→T：A顛換(2/3)。 第二部分：甲氧化三丁基錫的一般毒性和遺傳毒性評(píng)價(jià)。 1.小鼠急性毒性試驗(yàn)：甲氧化三丁基錫對(duì)小鼠的LD50為98mg/kg，其95％可信限為85mg/kg-113mg/kg，回歸方程為Y(幾率單位)=-5.97+5.507×LogD(

14、D：劑量)，其劑量-死亡率關(guān)系為拋物線型。按化學(xué)品的毒性分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)屬中等毒性。急性中毒的死亡類型不是速死型，多在3-5天發(fā)生。在整個(gè)試驗(yàn)期內(nèi)，甲氧化三丁基錫具有抑制小鼠體重增長(zhǎng)的作用。 2.甲氧化三丁基錫小鼠具有遺傳毒性。可導(dǎo)致小鼠精子畸形、睪丸的臟器系數(shù)降低。但Ames試驗(yàn)、CHL染色體畸變?cè)囼?yàn)、小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核試驗(yàn)、小鼠脾淋巴細(xì)胞hprt基因突變?cè)囼?yàn)均為陰性結(jié)果。 第三部分：甲氧化三丁基錫誘導(dǎo)人JurkatT淋

15、巴瘤細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制研究。 通過本課題的研究可以得出如下結(jié)論：①GFP轉(zhuǎn)基因小鼠可作為小鼠脾淋巴細(xì)胞hprt基因突變?cè)囼?yàn)的良好模型，具有準(zhǔn)確性高、降低了試驗(yàn)難度等優(yōu)點(diǎn)。GFP轉(zhuǎn)基因小鼠對(duì)模式誘變劑ENU誘導(dǎo)外周血嗜多染紅細(xì)胞的微核率與普通小鼠基本相同。結(jié)果證明了新方法是可行有效的。②甲氧化三丁基對(duì)小鼠的LDso為98mg/kg，按化學(xué)品的毒性分級(jí)劃分標(biāo)準(zhǔn)屬中等毒性，其劑量-死亡率關(guān)系為拋物線型，急性中毒的死亡不是速死型；甲氧化

16、三丁基可抑制小鼠的體重增長(zhǎng)，降低睪丸的臟器系數(shù)。③甲氧化三丁基錫具有一定的遺傳毒性，可導(dǎo)致小鼠精子畸形，雄性生殖系統(tǒng)是其主要靶器官之一。但遺傳毒理學(xué)試驗(yàn)Ames試驗(yàn)、CHL染色體畸變?cè)囼?yàn)、小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核試驗(yàn)、小鼠脾淋巴細(xì)胞hprt基因突變?cè)囼?yàn)為陰性結(jié)果。④甲氧化三丁基可通過線粒體途徑誘導(dǎo)Jurkat人淋巴瘤細(xì)胞凋亡，鈣離子是其中最初的信號(hào)因子；甲氧化三丁基阻滯Jurkat細(xì)胞于細(xì)胞周期的S期。凋亡事件包括磷脂酰絲氨酸外翻、ca