彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤bcl-2、bcl-6基因所在染色體區(qū)域異常的檢測及意義.pdf

1、目的 一、探究采用免疫組化方法對DLBCL進(jìn)行分子亞分類對臨床診療有無指導(dǎo)意義。 二、建立石蠟包埋組織進(jìn)行FISH檢測的一套方法，并探究使用該方法進(jìn)行FISH檢測DLBCLt(14；18)(q32；q21)染色體易位、擴(kuò)增及3q27斷裂、擴(kuò)增的可行性。 三、明確DLBCLbcl-2基因t(14；18)(q32；q21)染色體易位及bcl-2基因染色體擴(kuò)增與蛋白表達(dá)、分子分類及臨床因素的關(guān)系。 四、明確DL

2、BCLbcl-6基因相關(guān)的3q27斷裂及擴(kuò)增情況，闡明其與分子分類及臨床預(yù)后的相關(guān)性，研究其對指導(dǎo)DLBCL的臨床分類及治療的意義。 方法 一.研究對象 收集南方醫(yī)科大學(xué)附屬南方醫(yī)院病理科、廣州市第一人民醫(yī)院病理科、廣東省武警總隊(duì)醫(yī)院病理科、廣州市金域醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中心1999-2005年外檢中診斷為DLBCL的標(biāo)本，切片經(jīng)HE染色、免疫組化染色，重新閱片，診斷標(biāo)準(zhǔn)按照WHO“造血和淋巴組織腫瘤性疾病”新分類(2001

3、)，確定60例為DLBCL。60例DLBCL中，經(jīng)過正規(guī)CHOP方案治療的病例有36例，歸為一組，用于分析臨床療效及各因素之間的關(guān)系。在實(shí)驗(yàn)方法學(xué)的研究中所需的其它組織標(biāo)本均取自南方醫(yī)院病理科。 二.DLBCL的亞分類 采用Hans等人創(chuàng)建的利用免疫組化方法對DLBCL進(jìn)行亞分類，選用CD10、BCL-6和MUM1三種抗體。其中CD10、BCL-6作為生發(fā)中心細(xì)胞的標(biāo)記物，CD10+或CD10+/BCL-6+，為GCB類

4、；CD10-/BCL-6-，為non-GCB類；MUM1表達(dá)于B細(xì)胞發(fā)育后期，作為后生發(fā)中心來源的標(biāo)志物，若CD10-/BCL-6+，則用MUM1來分類：MUM1+為non-GCB類，MUM1-為GCB類。 采用了組織微陣列技術(shù)(TMA)進(jìn)行免疫組化染色，同時(shí)還檢測了bcl-2基因在DLBCL中的表達(dá)情況。 三.PCR檢測t(14；18)(q32；q21)染色體異位 本文采用PCR及FISH兩種方法檢測DLBCL

5、的t(14；18)(q32；q21)染色體異位。t(14；18)(q32；q21)染色體異位其主要斷裂區(qū)(MBR)約占60％～70％，基因的斷裂點(diǎn)則相對恒定，主要在J區(qū)，正因?yàn)镸BR的斷裂點(diǎn)比較恒定，因此可以采用PCR法對其進(jìn)行檢測，對檢測陽性的產(chǎn)物通過TA克隆及測序進(jìn)行驗(yàn)證。 為了提高檢測的特異度，我們還設(shè)計(jì)了用半巢式PCR對t(14；18)(q32；q21)進(jìn)行檢測的方法。即利用專業(yè)的引物設(shè)計(jì)軟件Primerpremier在

6、原有的檢測t(14；18)(q32；q21)MBR引物的下游設(shè)計(jì)了第二重引物，與原下游引物構(gòu)成半巢式PCR反應(yīng)的第二對引物，來提高檢測的準(zhǔn)確性，并通過測DNA序進(jìn)行證實(shí)。 四.細(xì)胞及細(xì)胞核陣列的制作及應(yīng)用 在進(jìn)行DLBCL的FISH實(shí)驗(yàn)時(shí)，我們嘗試著對石蠟包埋的組織進(jìn)行較厚的切片，經(jīng)脫蠟及蛋白酶K消化，從中提取出完整的細(xì)胞核進(jìn)行檢測。為了保證所提取出的細(xì)胞核大部分為腫瘤的細(xì)胞核， 同時(shí)還對這種制作陣列的方法是否適

7、用于mRNA的原位雜交及免疫細(xì)胞化學(xué)染色進(jìn)行了驗(yàn)證。 五.FISH檢測t(14；18)(q32；q21)染色體異位及bcl-2基因擴(kuò)增 檢測t(14；18)(q32；q21)的FISH探針購于美國Vysis公司，該探針由兩部分組成：一種為IgH特異性位點(diǎn)探針，用SpectrumGreen標(biāo)記，為綠色熒光；另一部分為bcl-2基因特異性位點(diǎn)探針，SpectrumOrange標(biāo)記。 六.FISH檢測染色體3q27斷裂

8、及擴(kuò)增 檢測3q27斷裂點(diǎn)的探針包含了分別以SpectrumGreen及SpectrumOrange標(biāo)記的兩段bcl-6基因探針，長度分別為300kb及600kb，這兩段序列位于染色體3q27，其間有長約42kb的間隙，恰好跨越了3q27染色體的斷裂位點(diǎn)。利用3q27斷裂點(diǎn)探針組進(jìn)行FISH時(shí)，正常的有絲分裂間期細(xì)胞核可以見到兩融合的信號(hào)(黃色信號(hào)或橙綠信號(hào)連在一起)；存在3q27斷裂的細(xì)胞核進(jìn)行FISH時(shí)表現(xiàn)為一個(gè)橙色信號(hào)一個(gè)

9、綠色信號(hào)及一個(gè)融合信號(hào)或兩個(gè)橙色信號(hào)，兩個(gè)綠色信號(hào)。 如果在一個(gè)細(xì)胞核中發(fā)現(xiàn)了3個(gè)以上的融合信號(hào)或3個(gè)以上的單色信號(hào)，則確定為存在3q27的擴(kuò)增。 七.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 分析各因素間關(guān)系時(shí)采用χ2檢驗(yàn)，樣本例數(shù)較少時(shí)采用Fisher精確概率檢驗(yàn)(Fisher'sExactTest)，等級(jí)資料采用兩獨(dú)立樣本非參數(shù)檢驗(yàn)(Mann-WhitneyU)。 統(tǒng)計(jì)軟件使用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件包。 結(jié)果

10、一.病例情況 按DLBCL診斷標(biāo)準(zhǔn)，共檢出DLBCL60例，其中男性35例，女性25例，平均年齡51歲(16歲-82歲)。 有36例經(jīng)過正規(guī)的CHOP方案治療，其中男性22例，女性14例平均年齡50歲(16歲-82歲)。治療結(jié)果：治療顯效15例，部分有效13例，無效8例。 二.PCR檢測t(14；18)(q32；q21)染色體異位 在驗(yàn)證我們創(chuàng)建的“無DNA原則”能否有效預(yù)防PCR污染的實(shí)驗(yàn)中，用陽性質(zhì)粒

11、污染操作者的手套，再按照我們的操作原則進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，均未出現(xiàn)假陽性。 三.細(xì)胞及細(xì)胞核陣列的制作及應(yīng)用結(jié)果 利用本研究的實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行細(xì)胞核提取，提取出的細(xì)胞核滴于載玻片上然后以蘇木素-伊紅染色觀察，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞漿均已去除，細(xì)胞核懸液中雜質(zhì)少，細(xì)胞核形態(tài)結(jié)構(gòu)完整清晰。成功制作了60例DLBCL石蠟包埋組織提取的細(xì)胞核陣列及鼻咽癌細(xì)胞系，淋巴瘤細(xì)胞系的細(xì)胞陣列，每個(gè)細(xì)胞芯中含細(xì)胞數(shù)目為500-1500個(gè)，平均1100個(gè)。將制成的陣列

12、成功用于熒光原位雜交，mRNA原位雜交及細(xì)胞化學(xué)染色。 四.TMA對DLBCL進(jìn)行亞分類結(jié)果 TMA技術(shù)改進(jìn)結(jié)果：利用在本研究設(shè)計(jì)的陣列組的實(shí)驗(yàn)方法，成功的在同一載玻片上排列了來自8個(gè)微陣列蠟塊的樣本，合計(jì)2,560個(gè)組織芯，640例組織。在脫蠟及HE染色效果良好，僅有個(gè)別組織芯脫落，本研究設(shè)計(jì)的組織芯間距為25微米，這樣就保證了即使在油鏡下也可以方便的找到相鄰的組織芯，這在進(jìn)行FISH觀察中是非常有用的。 五.

13、DLBCL分子亞類與臨床因素的關(guān)系 在檢出的29例GCB類DLBCL中，治療顯效、部分有效、無效的例數(shù)分別為9(64.3％)、4(28.6％)、1(7.1％)；在31例non-GCBGCB類DLBCL中，分別為6(27.3％)、9(40.9％)、7(31.8％)；GCB療效好于non-GCB，P=0.021。以蛋白表型為基礎(chǔ)的分子分類與臨床治療效果有相關(guān)性。 六.DLBCLbcl-2基因及所在染色體區(qū)異常與蛋白表達(dá)及臨床

14、因素之間的關(guān)系 FISH檢測t(14；18)(q32；q21)陽性的10例病例中，GCB8(80.0％)例，non-GCB2(20.0％)例，而無t(14；18)的病例中，GCB及non-GCB所占的比例分別為21(42.0％)、29(58.0％)，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.031)，PCR法檢測t(14；18)(q32；q21)陽性的5例均為GCB(P=0.022)。 七.DLBCLbcl-6基因及所在染色體區(qū)異常與蛋白表

15、達(dá)及臨床因素之間的關(guān)系 在60例DLBCL中，3q27染色體斷裂的有15例，無3q27染色體斷裂45例。存在3q27染色體斷裂的15例，BCL-6蛋白表達(dá)情況為BCL-6陽性3(20.0％)例，陰性12(80.0％)例。無3q27染色體斷裂45例中，BCL-6陽性25(55.6％)例，BCL-6陰性：20(44.4％)例。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示P=0.017，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，3q27染色體斷裂的病例，其BCL-6蛋白表達(dá)率降低。 結(jié)

16、論 1PCR實(shí)驗(yàn)中采用我們自創(chuàng)的“無DNA原則”可有效預(yù)防污染。 2采用本文所創(chuàng)建的方法可以在石蠟包埋組織中提取出細(xì)胞核，制成細(xì)胞核微陣列，該陣列應(yīng)用于FISH檢測，同一性好，節(jié)約實(shí)驗(yàn)時(shí)間，降低了實(shí)驗(yàn)成本。 3利用陣列組的方法可以在同樣大小的載玻片上排列更多的組織芯，制出更大，質(zhì)量更好的組織微陣列。 4常規(guī)PCR方法檢測t(14；18)有可能發(fā)生假陽性，原因在于人類基因組中存在一些可以與傳統(tǒng)引物部分配對的

17、基因，通過半巢式PCR檢測可以避免假陽性的發(fā)生。 5以蛋白表型為基礎(chǔ)對DLBCL可進(jìn)行亞分類，該分類與臨床療效有相關(guān)性。MUM1陰性的病例治療效果要好于MUM1陽性的病例，提示MUM1可做為臨床治療效果判斷的一個(gè)有用的指標(biāo)。6在DLBCL病例中，t(14；18)(q32；q21)及bcl-2基因擴(kuò)增均可引起B(yǎng)CL-2蛋白的表達(dá)。由t(14；18)(q32；q21)引起B(yǎng)CL-2蛋白表達(dá)的病例劃分為GCB的可能性大，由bcl-2基