乙肝病毒標志物定量及其與E抗原血清學(xué)轉(zhuǎn)換關(guān)系.pdf

1、研究背景:
　　 1965年，美國科學(xué)家Blumberg首次在澳大利亞土著人血清中發(fā)現(xiàn)“澳大利亞抗原”。其隨后被確定為乙型肝炎表面抗原(Hepatitis B surface antigen，HBsAg)，是乙肝病毒(Hepatitis BVirus，HBV)感染后最早出現(xiàn)于患者血清中的HBV標志物。若HBsAg在患者血清中持續(xù)時間超過6個月，即可診斷為慢性乙型肝炎病毒感染(Chronic hepatitis B，CHB)。據(jù)世

2、界衛(wèi)生組織WHO報道，全世界有3.5億左右慢性HBV感染者，每年大約有100萬人因HBV感染引起的并發(fā)癥而死亡。如肝硬化(Cirrosis)、肝衰竭(Liver faliure)和原發(fā)性肝細胞癌(Hepatocellular Carcinoma, HCC)。因此，慢性乙型肝炎患者的管理與治療是個艱巨而意義重大的任務(wù)。
　　 乙肝病毒E抗原(Hepatitis B eantigen，HBeAg)與HBsAg同時或稍晚出現(xiàn)于感染者血

3、清中，是乙肝病毒在體內(nèi)復(fù)制活躍的標志之一。在慢乙肝患者管理與治療過程中，若出現(xiàn)HBsAg或HBeAg消失，并產(chǎn)生表面抗體(Hepatitis B surface antibody, HBsAb)或E抗體(Hepatitis B eantibody, HBeAb)，即發(fā)生血清學(xué)轉(zhuǎn)換(Seroconversion)。通常意味著體內(nèi)乙肝病毒復(fù)制活性降低，病情好轉(zhuǎn)，是常用的評估病情和治療效果的指標，是重要的臨床治療終點。越來越多的臨床研究發(fā)現(xiàn)，

4、治療前血清HBsAg和HBeAg低水平與其高血清學(xué)轉(zhuǎn)換率密切相關(guān)。
　　 隨著檢測技術(shù)的發(fā)展，定量檢測HBsAg和HBeAg水平已成為可能。這為我們深入探討HBsAg和HBeAg水平及其變化模式評估HBV抗病毒療效提供了新手段。
　　 因此，我們需要能準確定量血清HBsAg和HBeAg水平的檢測方法。目前，有兩種試劑可以定量檢測血清HBsAg水平，分別是美國雅培公司和德國羅氏公司的HBsAg檢測方法。其中最為廣泛使用的是

5、雅培表面抗原檢測方法。而羅氏表面抗原檢測方法可以通過簡單的稀釋步驟和轉(zhuǎn)換實現(xiàn)HBsAg定量檢測。Karsten Wursthorn和Milan J.Sonneveld等研究團隊已經(jīng)對兩種檢測方法進行比較，發(fā)現(xiàn)二者之間的結(jié)果具有很高的相關(guān)性。但是其研究病例基因型分布以A型和D型為主，而我國分布主要是C型和B型，故本研究第一部分比較雅培和羅氏HBsAg檢測方法定量檢測基因型B和C患者血清HBsAg水平的相關(guān)性和差異性。
　　 目前國

6、際上尚無HBeAg定量檢測試劑，但是雅培和羅氏HBeAg檢測方法都可以通過PEIU標準品，制作標準曲線，然后實現(xiàn)定量檢測血清HBeAg水平。雅培E抗原試劑每次更換批號時，需要重新制作標準曲線;而羅氏HBeAg試劑可以直接使用由公司提供的定量轉(zhuǎn)換公式，不受試劑批號影響。第二部分主要比較雅培和羅氏HBeAg檢測方法定量檢測結(jié)果的一致性。
　　 乙肝病毒C基因區(qū)高度易變，常見變異位點G1896A變異和A1762T/G1764A雙變異。

7、前者可使HBeAg翻譯提前終止，而A1762T/G1764A雙變異可明顯降低血清HBeAg水平。而血清HBeAg低水平者易于發(fā)生血清學(xué)轉(zhuǎn)換。但是臨床實踐中，我們亦觀察到部分病例持續(xù)維持低水平E抗原，而不發(fā)生E抗原血清學(xué)轉(zhuǎn)換。我們推測，是否造成HBeAg定量降低的原因的差異，導(dǎo)致其結(jié)果的不同。因此，第三部分研究主要著重結(jié)合BCP/PC變異，觀察E抗原定量水平對血清學(xué)轉(zhuǎn)換發(fā)生率的影響，從而提高HBeAg定量水平對抗病毒治療療效的評估預(yù)測能力

8、。
　　 研究目的:
　　 1.結(jié)合基因型及抗病毒治療狀態(tài)，比較羅氏與雅培試劑定量檢測乙肝E抗原陽性患者血清HBsAg和HBeAg水平的相關(guān)性與差異性。
　　 2.結(jié)合BCP/PC變異，觀察血清HBeAg定量水平對HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換發(fā)生率的影響，從而提高HBeAg定量水平對抗病毒治療療效的評估預(yù)測能力。
　　 研究方法:
　　 1.比較雅培和羅氏試劑檢測血清HBsAg和HBeAg水平的相關(guān)性與差

9、異性
　　 1.1、研究樣本來源
　　 共收集1308例乙肝患者病例血清，均來自廣州市南方醫(yī)院肝病中心。所有血清均同時接受雅培和羅氏兩種表面抗原和E抗原方法檢測，其中16份血清未納入定量分析比較，因兩種或一種方法檢測其E抗原為陰性。所有血清檢測前均被分裝為成兩份，保存于-30℃冰箱。
　　 1.2、雅培和羅氏檢驗方法
　　 1.2.1、HBsAg檢測方法
　　 雅培HBsAg方法是化學(xué)發(fā)光微粒法，

10、羅氏方法是電子化學(xué)發(fā)光微粒法。前者是直接定量檢測方法，而羅氏HBsAg方法需要通過簡單的稀釋步驟和轉(zhuǎn)換實現(xiàn)定量檢測血清HBsAg水平。
　　 1.2.2、HBeAg檢測方法
　　 雅培和羅氏HBeAg方法都是定性檢測方法，但是通過PEIU標準品制作標準曲線來定量檢測血清HBeAg水平。
　　 1.3、基因型測定
　　 對與乙肝病毒聚合酶逆轉(zhuǎn)錄區(qū)B\C亞區(qū)部分重疊的表面抗原編碼區(qū)進行直接測序，然后進行系統(tǒng)樹

11、構(gòu)建分型。
　　 1.4、統(tǒng)計分析
　　 所有結(jié)果在分析前均取10為底的對數(shù)值，兩種方法的相關(guān)性比較使用SPSS18.0統(tǒng)計軟件進行Pearson相關(guān)分析;連續(xù)變量的分組比較采用非參數(shù)方法Mann-Whitney;兩種方法差異性分析采用Graphpad prism5.0軟件Bland-Altmanplot進行描述。所有分析均采用雙側(cè)檢驗，若P＜0.05，則認為有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 2.HBeAg定量與BCP/PC

12、變異及其血清學(xué)轉(zhuǎn)換關(guān)系研究
　　 2.1、病例來源
　　 患者來自南方醫(yī)院肝病中心參加“國家十一五重大專項”EFFORT臨床研究的受試者共83例。
　　 2.2、基因變異分析
　　 用DNA抽提試劑盒(QIAamp DNA Blood Mini Kit)提取血清HBV DNA，巢氏PCR擴增C基因區(qū)并將第二輪產(chǎn)物送英駿公司進行直接測序。序列峰圖用Chromas軟件分析，變異判斷用Mutation surv

13、eyor軟件3.0分析。
　　 2.3、統(tǒng)計分析
　　 所有數(shù)據(jù)均使用SPSS18.0統(tǒng)計軟件進行分析。分組間比較采用非參數(shù)Mann-Whituey方法分析，多組間比較采用Kruskal-Wallis H檢驗，率的比較用Fisher精確檢驗分析，所有結(jié)果均采用雙側(cè)檢驗，P＜0.05被認為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。HBV DNA和HBeAg在分析前取10為底的對數(shù)值。
　　 研究結(jié)果:
　　 1.比較雅培和羅氏試劑

14、檢測血清HBsAg和HBeAg水平的相關(guān)性與差異性
　　 1.1、基因型分布與治療狀態(tài)
　　 根據(jù)直接測序及種系發(fā)生分析，血清總體基因型分布為:B基因型組:514例(39.78％);C基因型組776例(60.06％)，D基因型2例(0.16％)。核苷初治組基因型分布為:B基因型442例(39.46％);C基因型676例(60.36％)，D基因型2例(0.18％)。根據(jù)治療狀態(tài)，分別有1120(86.69％)份未治療患者血

15、清納入初治組，172(13.31％)血清納入治療組。
　　 1.2、治療前血清HBsAg和HBeAg水平與基因分布關(guān)系
　　 治療前表面抗原分布因基因型不同而有顯著差異，基因型B組表面抗原定量高于基因型C組(中位數(shù)B(∶)c:4.53 vs4.08 log10 IU/mL，P=0.000，Z=-10.845);治療前樣本不同基因型E抗原定量的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(中位數(shù)B(∶)c:2.96 vs2.88log10 PEI U

16、/mL,P=0.203,Z=-1.274)。
　　 1.3、系統(tǒng)性比較
　　 雅培和羅氏HBsAg方法系統(tǒng)性比較，其相關(guān)系數(shù)是0.939(95％ CI:0.932～0.945)，P=0.000。而其差異性為:log10 IU/mL[羅氏]- log10 IU/mL[雅培]=0.075±0.241 log10 IU/mL。而兩種檢測方法定量檢測HBeAg水平系統(tǒng)性比較，其相關(guān)系數(shù)是0.987(95％ CI:0.985～0.

17、988)，P=0.000。而其差異性為:log10 PEIU/ml[羅氏]-log10PE IU/ml[雅培]）=-0.149±0.165 log10 PE IU/ml。
　　 1.4、基因型分組比較
　　 根據(jù)基因型分成基因型B組和C組，兩種HBsAg檢測方法相關(guān)系數(shù)分別為0.942(95％ CI:0.932～0.951)和0.948(95％CI:0.940～0.955)，P=0.000。而其差異性（比率（羅氏/雅培）

18、）分別為0.993和1.037。兩種HBeAg檢測方法其相關(guān)系數(shù)分別為0.988(95％ CI:0.985～0.990)和0.986(95％ CI:0.984～0.988)，P=0.000。而其差異性（比率（羅氏/雅培））分別為0.815和0.957。
　　 1.5、治療狀態(tài)分組比較
　　 根據(jù)治療狀態(tài)，各基因型組分別被分為兩組，B基因型組治療前HBsAg相關(guān)性為0.919(95％ CI:0.903～0.932)，治療后

19、相關(guān)性為0.979(95％ CI:0.967～0.987)，P=0.000。而C基因型組治療前HBsAg相關(guān)性為0.945(95％ CI:0.936～0.952);治療后相關(guān)性0.956(95％ CI:0.935～0.970)， P=0.000。B基因型組治療前HBeAg相關(guān)性為0.985(95％ CI:0.981～0.987;治療后HBeAg相關(guān)性為0.980(95％ CI:0.968～0.988， P=0.000。而C基因型組治療前

20、HBeAg相關(guān)性為0.984(95％ CI:0.981～0.986);治療后HBeAg相關(guān)性0.982(95％ CI:0.973～0.988), P=0.000。
　　 2.HBeAg定量與BCP/PC變異及其血清學(xué)轉(zhuǎn)換關(guān)系研究
　　 2.1、治療52周累積HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換率與基線期HBeAg定量關(guān)系
　　 根據(jù)HBeAg水平是否大于2.44 log10PEIU/ml，分為HBeAg低定量組和HBeAg高定量

21、組，其隨訪12周、24周、36周、52周時HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換率為23.53％ VS0％(P=0.003),35.29％ VS1.92％( P=0.001),41.18％ VS5.77％(P=0.001),52.94％ VS17.31％(P=0.009)。
　　 2.2、BCP/PC變異與基線期E抗原定量關(guān)系研究
　　 變異組與野生株組E抗原定量水平有區(qū)別，有統(tǒng)計學(xué)意義(中位數(shù)變異組:野生組:2.69 VS3.12 lo

22、g10PEI U/ml，P=0.032);以HBV DNA校正后，同樣有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.003)。1762A/1764T純合變異者E抗原定量中位數(shù)為2.11 log10 PEIU/ml，雜合變異者E抗原定量中位數(shù)為3.10 log10PEI U/ml，野生株E抗原定量中位數(shù)為3.08 log10 PEI U/ml，三組之間E抗原定量有統(tǒng)計學(xué)意義差別(P=0.002)。而雜合變異組與野生組之間差別無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.693)。以HB

23、V DNA水平作為校正因素，比較三組間區(qū)別，同樣有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.006)，而雜合變異組與野生組之間無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.973)。
　　 2.3、BCP/PC變異與治療各期E抗原血清學(xué)轉(zhuǎn)換率關(guān)系研究
　　 變異組與野生組隨訪12周、24周、36周、52周時HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換率為9.5％ VS0.0％(P=0.150),9.5％ VS11.1％(P=1.00),9.5％ VS22.2％(P=0.173),23.8％

24、 VS29.6％(P=0.589)。
　　 研究結(jié)論:
　　 1.雅培與羅氏HBsAg方法和HBeAg方法定量檢測結(jié)果均具有較高的相關(guān)性和低差異性，且不受治療狀態(tài)和基因型影響。兩種檢測方法均可用于臨床與科研定量檢測HBsAg和HBeAg水平。
　　 2.G1896A和/或A1762T/G1764A變異可明顯降低血清HBeAg水平。
　　 3.血清HBeAg低定量水平時，發(fā)生HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換的概率更高。