鼠干細(xì)胞（胚胎、間充質(zhì)）體外定向分化為心肌細(xì)胞及心臟移植的動物試驗(yàn)研究.pdf

1、第一部分 小鼠胚胎干細(xì)胞體外定向分化心肌細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究;眾所周知,心肌細(xì)胞屬永久細(xì)胞,既終末分化細(xì)胞,因此,心肌細(xì)胞損傷后再生問題一直是現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的重大難題,該實(shí)驗(yàn)旨在建立小鼠胚胎干細(xì)胞體外定向誘導(dǎo)分化為心肌細(xì)胞的模型,摸索小鼠胚胎干細(xì)胞體外培養(yǎng)和擴(kuò)增的適宜環(huán)境和條件,探討小鼠胚胎干細(xì)胞體外定向分化為心肌細(xì)胞的誘導(dǎo)條件及影響因素.盡管目前關(guān)于人類胚胎干細(xì)胞的培養(yǎng)和誘導(dǎo)分化工作尚在初級階段,小鼠胚胎干細(xì)胞的研究有助于對人類胚胎干細(xì)胞理解和

2、認(rèn)識,促進(jìn)對人類心肌細(xì)胞的分化與再生的認(rèn)識和研究,并最終為臨床心肌損害的治療開拓了一條新的思路,具有特殊的科學(xué)意義和臨床應(yīng)用前景.1.絲裂霉素Cμg10/ml的濃度1小時對于小鼠胎兒成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)層的制備具有較好的效果.2.小鼠胚胎干細(xì)胞在小鼠原代胎兒成纖維細(xì)胞制備的飼養(yǎng)層上,用加入LIF1000U/ml的胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng),既能實(shí)現(xiàn)胚胎性干細(xì)胞體外擴(kuò)增,又能最大限度抑制干細(xì)胞分化.3.加入合適的誘導(dǎo)劑;二甲基亞風(fēng)(DMSO dime

3、thyl sulfoxide)和維甲酸(RA retinoic acid),ES細(xì)胞體外經(jīng)RA、DMSO的定向誘導(dǎo)分化為具有自律性跳動的心肌細(xì)胞團(tuán).4.條件心肌細(xì)胞誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基能同樣促進(jìn)ES細(xì)胞向心肌細(xì)胞的定向分化,由此推論:新生鼠心臟中存在一種能促進(jìn)ES向心肌分化和生長的物質(zhì)或細(xì)胞因子,既促心肌細(xì)胞分化生長因子.5.細(xì)胞免疫組化鑒定:部分小鼠胚胎干細(xì)胞經(jīng)細(xì)胞免疫組化鑒定證實(shí)分化為心肌細(xì)胞,肌球蛋白、肌動蛋白及心肌特異性肌鈣蛋白在分化

4、的心肌細(xì)胞中兩組有陽性表達(dá),對照組優(yōu)于實(shí)驗(yàn)組光鏡下呈棕黃色顆粒.第二、三部分 大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外定向分化為心肌細(xì)胞及心肌移植的動物實(shí)驗(yàn)研究;該實(shí)驗(yàn)從大鼠骨髓分離、培養(yǎng)、擴(kuò)增MSCs,并在體外向心肌細(xì)胞誘導(dǎo),旨在建立大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外定向分化為心肌細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?探討MSCs體外定向誘導(dǎo)分化為心肌細(xì)胞的誘導(dǎo)條件和影響因素,通過MSCs心肌移植的動物試驗(yàn)研究,初步了解MSCs細(xì)胞在移植后的存活、增殖狀態(tài).有助于人類骨髓間充質(zhì)干

5、細(xì)胞向心肌細(xì)胞定向分化的了解和認(rèn)識.并最終為臨床心肌損害的治療開辟一條嶄新的途徑.1.從骨髓分離、培養(yǎng)單個核細(xì)胞呈貼壁生長,成纖維細(xì)胞樣及多型性外觀.2.MSCs具有多向分化潛能,體外5-氮胞苷孵育24小時,可被定向誘導(dǎo)分化為心肌形態(tài)的細(xì)胞.細(xì)胞免疫組化檢測:肌球蛋白、肌動蛋白及心肌特異性肌鈣蛋白在分化的心肌細(xì)胞中有棕黃色顆粒陽性表達(dá).3.骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞條件誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基能促進(jìn)MSCs細(xì)胞向心肌細(xì)胞的定向分化.由此推論:新生鼠心臟中存