氧環(huán)境通過FNR蛋白調(diào)控大腸桿菌SM10接合反應(yīng)的機(jī)制研究.pdf

1、目前從臨床分離的耐藥性致病菌中檢測(cè)到種類不同的耐藥基因，說明細(xì)菌間的耐藥基因水平轉(zhuǎn)移(HGT)是導(dǎo)致耐藥性加劇的重要原因。細(xì)菌之間耐藥基因水平轉(zhuǎn)移有轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)化和接合三種方式，而接合(conjugation)是耐藥基因水平轉(zhuǎn)移的一個(gè)主要方式。接合是通過性菌毛互相溝通，將遺傳物質(zhì)(主要是質(zhì)粒DNA)從供體菌轉(zhuǎn)移給受體菌的過程。由于在多種細(xì)菌間均能穩(wěn)定存在，多年以來寬宿主質(zhì)粒RP4一直是研究細(xì)菌間接合的模式質(zhì)粒。為了利用RP4質(zhì)粒的基因轉(zhuǎn)移功

2、能將大腸桿菌中的基因轉(zhuǎn)移到其他革蘭氏陰性菌，同時(shí)避免RP4質(zhì)粒的自我轉(zhuǎn)移，R.Simon等將RP4質(zhì)粒整合到了大腸桿菌(Escherichia coli,E.coli) S49-20(recA-)基因組上，構(gòu)建了接合菌株SM10。本課題組在前期小鼠實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)氧環(huán)境對(duì)E.coli SM10與銅綠假單胞菌(PA)PAO1之間接合反應(yīng)的接合效率產(chǎn)生影響。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步探索氧這一環(huán)境因素對(duì)接合反應(yīng)的調(diào)控機(jī)制。
　　首先，從接合頻率的表型上，

3、試驗(yàn)以大腸桿菌SM10作為接合的供體菌，分別以PAO1和EC600作為受體菌，發(fā)現(xiàn)無論是濾膜雜交法還是液體接合法，厭氧條件下的接合效率都會(huì)明顯低于有氧條件下的接合效率。
　　繼而本實(shí)驗(yàn)探索了氧環(huán)境對(duì)接合反應(yīng)調(diào)控的分子機(jī)制。實(shí)驗(yàn)從大腸桿菌轉(zhuǎn)錄因子系統(tǒng)著手，探究了是否存在大腸桿菌SM10的轉(zhuǎn)錄因子能夠?qū)φ腺|(zhì)粒RP4進(jìn)行調(diào)控從而影響SM10的接合功能。大腸桿菌的FNR(fumarate and nitrate reduction)蛋白

4、是細(xì)菌厭氧環(huán)境下的全局調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子，屬于大腸桿菌單組分調(diào)控系統(tǒng)[4]。在厭氧環(huán)境下，大約有三分之一的大腸桿菌基因表達(dá)與在有氧環(huán)境下不同，在這些基因中又有712(49％)個(gè)受到FNR蛋白直接或者間接的調(diào)控[5]。由此，實(shí)驗(yàn)采用Red同源重組技術(shù)突變缸基因，建立SM10△fnr基因突變株，并分別以SM10和SM10△fnr為供體菌，PAO1和EC600為受體菌，然后再分別進(jìn)行有氧、厭氧接合。結(jié)果顯示在有氧環(huán)境下，fnr基因突變株與受體菌PA

5、O1或EC600的接合效率均升高;在厭氧環(huán)境下，fnr基因突變株與PAO1的接合效率降低，但與EC600的接合效率升高。
　　最后，實(shí)驗(yàn)通過瓊脂糖凝膠遷移實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)FNR蛋白能在體外結(jié)合RP4質(zhì)粒korC基因啟動(dòng)子區(qū)域，提示fnr通過korC調(diào)控RP4質(zhì)粒接合反應(yīng)。
　　綜上所述，本實(shí)驗(yàn)探索了氧環(huán)境對(duì)大腸桿菌SM10接合反應(yīng)的調(diào)控機(jī)制，發(fā)現(xiàn)氧環(huán)境可以通過FNR蛋白調(diào)控SM10接合反應(yīng)，為以后更全面地探索接合反應(yīng)提供了新的研究思

6、路。同時(shí)因?yàn)榻雍嫌质悄退幓蛩睫D(zhuǎn)移的一個(gè)重要方式，本研究結(jié)果同時(shí)對(duì)耐藥基因轉(zhuǎn)移的研究開辟了新的方向。因此，本實(shí)驗(yàn)具有一定的科學(xué)價(jià)值和臨床意義。
　　目的:探索氧環(huán)境對(duì)大腸桿菌SM10接合反應(yīng)的調(diào)控機(jī)制
　　方法:
　　1.濾膜雜交法[6]接合反應(yīng)和培養(yǎng)基液體接合反應(yīng)
　　將pUCP30T質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進(jìn)E.coli SM10培養(yǎng)為供體菌，銅綠假單胞菌PAO1和大腸桿菌EC600為受體菌，分別以濾膜雜交法和液體接合法進(jìn)

7、行接合實(shí)驗(yàn)研究氧環(huán)境對(duì)接合頻率的影響。
　　2.SM10中fnr基因的缺失突變
　　利用Red同源重組的方法將大腸桿菌SM10中的fnr基因缺失突變
　　3:fnr突變對(duì)SM10接合頻率頻率的影響
　　將pUCP30T質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化進(jìn)E.coli SM10和E.coli SM10△Fnr中，轉(zhuǎn)化成功的兩細(xì)菌均做有氧(aerobic)培養(yǎng)為供體菌，銅綠假單胞菌PAO1和大腸桿菌EC600為受體菌，兩組分別做有氧和厭氧

8、(anaerobic)接合，并分別以濾膜雜交法和液體接合法進(jìn)行接合實(shí)驗(yàn)研究氧環(huán)境和Fnr對(duì)接合頻率的影響。
　　4.fnr突變對(duì)接合相關(guān)基因的影響
　　采用熒光定量PCR分別檢測(cè)E.coli SM10(pUCP30T)和E.coliSM10△fnr((pUCP30T)在有氧和厭氧培養(yǎng)條件下接合相關(guān)基因的表達(dá)，觀察氧環(huán)境和fnr突變對(duì)接合相關(guān)基因的影響。
　　5.瓊脂糖凝膠遷移實(shí)驗(yàn)
　　通過構(gòu)建Fnr原核表達(dá)載體，

9、表達(dá)純化回收Fnr蛋白，與DNA探針進(jìn)行瓊脂糖凝膠遷移實(shí)驗(yàn)。
　　結(jié)果:
　　1.以大腸桿菌SM10作為接合的供體菌，分別以PAO1和EC600作為受體菌，無論是濾膜雜交法還是液體接合法，厭氧條件下的接合效率都會(huì)明顯低于有氧條件下的接合效率。
　　2.成功構(gòu)建fnr敲除菌SM10△fnr。
　　3.在有氧環(huán)境下，突變fnr基因后SM10-PAO1與SM10-EC600的接合效率都會(huì)升高。在厭氧環(huán)境中，突變fnr基

10、因后SM10-PAO1的接合效率降低， SM10-EC600的接合效率升高。
　　4.fnr基因突變后，無論有氧接合還是厭氧接合，所有的接合相關(guān)基因，包含所有的全局調(diào)控基因以及下游的功能基因表達(dá)量均下降。另一方面，KorA、korB及其下游基因traI的表達(dá)量厭氧接合時(shí)相對(duì)于有氧接合時(shí)會(huì)下降。KorC及其下游基因kleC、trbA及其下游基因trbE的表達(dá)量厭氧接合時(shí)相對(duì)于有氧接合時(shí)會(huì)上升。
　　5.瓊脂糖凝膠遷移實(shí)驗(yàn)顯示，