塔瑪亞歷山大藻對(duì)中國(guó)對(duì)蝦抗病力的影響機(jī)理研究.pdf

1、本論文選擇一株能產(chǎn)生麻痹性貝毒(paralytic shellfish poisoning, PSP)的赤潮甲藻塔瑪亞歷山大藻(Alexandrium tamarense, ATHK株)，研究了其對(duì)我國(guó)北方池塘主要水產(chǎn)養(yǎng)殖品種—中國(guó)對(duì)蝦(Fenneropenaeus chinensis)免疫功能和抗病力的影響，探討有毒藻類對(duì)養(yǎng)殖對(duì)蝦疾病的誘發(fā)機(jī)制。研究分為三個(gè)部分：
　　第一部分為塔瑪亞歷山大藻對(duì)中國(guó)對(duì)蝦毒性的初步研究。
　

2、　對(duì)塔瑪亞歷山大藻ATHK藻株在實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)的條件下生長(zhǎng)情況進(jìn)行了研究；利用美國(guó)分析化學(xué)家協(xié)會(huì)(Association of Official Analytical Chemists, AOAC)所推薦的小鼠生物法(mouse bioassay, MBA)測(cè)定了不同生長(zhǎng)時(shí)期和不同培養(yǎng)溫度下的塔瑪亞歷山大藻的麻痹性貝毒毒性；采用浸浴方式研究了藻株對(duì)中國(guó)對(duì)蝦的急性毒性；采用 HE染色的方法，分別對(duì)在浸浴(1.0×104 cells/mL組)和

3、注射(6.63×104cells/mL組)后96 h的中國(guó)對(duì)蝦的鰓和肝胰腺石蠟切片進(jìn)行了觀察。結(jié)果表明，藻株屬中溫株，最適生長(zhǎng)溫度為20℃，此溫度下生長(zhǎng)率為0.24d-1；在最適生長(zhǎng)溫度下培養(yǎng)，藻株單位細(xì)胞毒性為1.85×10-5-4.57×10-5 MU/cel1(3.50-8.64 pg STX Equal/cell)，在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)末期達(dá)最大值，在同種藻株中屬低毒藻株；單位細(xì)胞毒性在本實(shí)驗(yàn)所設(shè)的溫度范圍(16-32℃)內(nèi)隨溫度增加而呈

4、下降趨勢(shì)；塔瑪亞歷山大藻對(duì)中國(guó)對(duì)蝦96 h半致死濃度(median lethal concentration, LC50)為1.0×104 cells/mL，安全濃度(safe concentration, SC)為1.0×103 cells/mL；石蠟切片觀察發(fā)現(xiàn)塔瑪亞歷山大藻和其毒素粗提液分別引起了對(duì)蝦鰓和肝胰腺出現(xiàn)細(xì)胞腫脹、空泡化等病理變化。
　　第二部分為塔瑪亞歷山大藻對(duì)中國(guó)對(duì)蝦鰓和肝胰腺組織SOD、GST、MDA和細(xì)胞凋

5、亡的影響
　　塔瑪亞歷山大藻粗提液經(jīng)肌肉注射方式染毒中國(guó)對(duì)蝦，于染毒后1、3、6、12、24和48 h測(cè)定肝胰腺和鰓組織的超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)，谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶(glutathione S-transferase,GST)活性和丙二醛(malonyldialdehyde, MDA)含量的影響。采用浸浴方式研究暴露于200 cells/mL和1000 cells/mL塔瑪亞歷山大藻中中

6、國(guó)對(duì)蝦鰓和肝胰腺的SOD活性、GST活性、MDA含量和Caspase(cysteinylaspartate specific proteinase, Caspase)基因(FcCasp)相對(duì)表達(dá)量，并對(duì)暴露96h后的中國(guó)對(duì)蝦肝胰腺細(xì)胞凋亡情況利用末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記法(TdT mediated dUTP nick end labeling, TUNEL)法進(jìn)行了檢測(cè)。結(jié)果顯示：注射染毒后1-6 h,對(duì)蝦肝胰腺和鰓組織S

7、OD，GST活性均增加，12和48 h鰓組織的上述指標(biāo)受到抑制(P<0.05)。對(duì)蝦肝胰腺M(fèi)DA含量除1 h外未見明顯改變(P>0.05)，鰓中MDA含量隨時(shí)間增加呈升高趨勢(shì)。200 cells/mL塔瑪亞歷山大藻脅迫下，中國(guó)對(duì)蝦鰓SOD活性、GST活性、MDA含量和FcCasp相對(duì)表達(dá)量均隨著取樣時(shí)間推移整體表現(xiàn)出先上升后下降的趨勢(shì)。1000 cells/mL塔瑪亞歷山大藻脅迫下，鰓SOD活性隨時(shí)間增加呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，在24-

8、96 h被顯著抑制(P<0.05)，鰓GST活性除3和48 h外均被顯著抑制(P<0.05)，MDA含量和FcCasp相對(duì)表達(dá)量均整體表現(xiàn)上升的趨勢(shì)，呈現(xiàn)出一定的時(shí)間效應(yīng)。200 cells/mL塔瑪亞歷山大藻脅迫下，肝胰腺SOD活性、GST活性、MDA含量和FcCasp相對(duì)表達(dá)量除個(gè)別時(shí)間點(diǎn)外，無顯著改變(P>0.05)。1000 cells/mL塔瑪亞歷山大藻脅迫下，肝胰腺的SOD和GST活性均隨著取樣時(shí)間推移整體表現(xiàn)出先上升后下降

9、的趨勢(shì)，肝胰腺M(fèi)DA含量在48-96 h顯著上升(P<0.05)，且在此時(shí)間段內(nèi)肝胰腺M(fèi)DA含量上升的趨勢(shì)和其GST活性下降的趨勢(shì)相一致。相關(guān)性分析顯示塔瑪亞歷山大藻脅迫下，中國(guó)對(duì)蝦鰓和肝胰腺的MDA含量和FcCasp相對(duì)表達(dá)量呈正相關(guān)(相關(guān)系數(shù)R2分別為0.8663和0.8606，P<0.05)。TUNEL分析顯示，1000 cells/mL塔瑪亞歷山大藻脅迫96 h，中國(guó)對(duì)蝦的肝胰腺出現(xiàn)明顯的細(xì)胞凋亡。研究表明：塔瑪亞歷山大藻及其毒

10、素對(duì)中國(guó)對(duì)蝦組織具有脂質(zhì)過氧化(lipid peroxidation, LPO)作用，引起MDA含量增加，SOD和GST活性降低。塔瑪亞歷山大藻可造成中國(guó)對(duì)蝦氧化損傷，從而導(dǎo)致FcCasp表達(dá)上調(diào)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。MDA含量和Caspase基因表達(dá)水平呈線性相關(guān)，表明了LPO在誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡中的作用。中國(guó)對(duì)蝦鰓組織中SOD活性，GST活性和MDA含量在塔瑪亞歷山大藻濃度高于200 cells/mL對(duì)塔瑪亞歷山大藻的變化有積極的響應(yīng)，其隨藻濃

11、度及其作用時(shí)間的不同而發(fā)生不同的變化，在作為有毒藻暴露的生物標(biāo)記物方面有較好的應(yīng)用前景。
　　第三部分為塔瑪亞歷山大藻對(duì)中國(guó)對(duì)蝦免疫相關(guān)基因表達(dá)和抗病力的影響。
　　克隆獲得了中國(guó)對(duì)蝦一氧化氮合成酶(nitric oxide synthase, NOS)基因全長(zhǎng)序列、分析該基因的特征、檢測(cè)了 NOS在對(duì)蝦各個(gè)組織的表達(dá)情況及副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)(5×106 CFU/mL)刺激下在對(duì)蝦鰓

12、和肝胰腺組織的表達(dá)情況；并研究了暴露于200和1000 cells/mL塔瑪亞歷山大藻中中國(guó)對(duì)蝦鰓和肝胰腺NOS基因的表達(dá)變化情況及暴露于不同濃度(100,200,500,1000,2000和4000 cells/mL)塔瑪亞歷山大藻后機(jī)體抗副溶血弧菌能力；研究了暴露于200和1000 cells/mL塔瑪亞歷山大藻中中國(guó)對(duì)蝦TLR基因和Relish基因的表達(dá)變化情況及抗白斑病毒(white spot syndrome virus, W

13、SSV)和鰻弧菌(Vibrio anguillarum)的能力。結(jié)果表明，NOS基因全長(zhǎng)4616 bp，包含3582 bp的開放閱讀框(ORF)，編碼一個(gè)由1193個(gè)氨基酸組成的多肽，起始密碼子(ATG)位于164-166位核苷酸，終止密碼子(TAG)位于3743-3745位核苷酸，5′和3′的非編碼區(qū)分別為163 bp和871 bp，含有四個(gè)ATTTA基序。NOS推導(dǎo)的氨基酸序列通過SMART進(jìn)行比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)該蛋白有從無脊椎動(dòng)物到脊

14、椎動(dòng)物都比較保守的多個(gè)蛋白家族保守序列，主要包含4個(gè)結(jié)構(gòu)域：NO synthase結(jié)構(gòu)域，flavodoxin1結(jié)構(gòu)域，黃素腺嘌呤二核苷酸(FAD)結(jié)合域和煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)結(jié)合域。中國(guó)對(duì)蝦NOS蛋白氨基端血紅素(Heme)和四氫葉酸(BH4)結(jié)合位點(diǎn)，羧基端黃素單核苷酸(FMN)、FAD和還原型煙酰胺腺苷二核苷酸磷酸(NADPH)結(jié)合位點(diǎn)，在脊椎動(dòng)物三種類型NOS和無脊椎動(dòng)物間也都高度保守。中國(guó)對(duì)蝦 NOS與昆蟲 NOS聚

15、為一支，與脊椎動(dòng)物的組成型NOS進(jìn)化關(guān)系更近，與凡納濱對(duì)蝦(Litopenaeus vannamei)和日本囊對(duì)蝦(Marsupenaeus japonicus)的同源性分別為97％和95%。中國(guó)對(duì)蝦NOS基因在鰓中的表達(dá)量最高，其次為肝胰腺。副溶血弧菌注射后中國(guó)對(duì)蝦鰓和肝胰腺組織 NOS基因在最初階段的表達(dá)量都顯著上調(diào)。200 cells/mL塔瑪亞歷山大藻脅迫下，中國(guó)對(duì)蝦的鰓和肝胰腺的NOS基因表達(dá)在實(shí)驗(yàn)初期有所上升，實(shí)驗(yàn)中后期均恢

16、復(fù)至對(duì)照組的水平，而1000 cells/mL塔瑪亞歷山大藻脅迫下對(duì)蝦鰓和肝胰腺組織的NOS基因表達(dá)分別在12 h后和72 h后被顯著抑制(P<0.05)。不同濃度塔瑪亞歷山大藻(100,200,500,1000,2000和4000 cells/mL)暴露6天后的中國(guó)對(duì)蝦，經(jīng)副溶血弧菌人工急性感染后，中國(guó)對(duì)蝦的累積死亡率在各時(shí)間點(diǎn)整體上呈現(xiàn)隨藻濃度的增加而增加的趨勢(shì)，500,1000,2000和4000 cells/mL塔瑪亞歷山大藻脅

17、迫組的累積死亡率在24,48和72 h均顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，而100和200 cells/mL塔瑪亞歷山大藻脅迫組在24,48和72 h的累積死亡率與對(duì)照組相比無顯著差異(P>0.05)。200 cells/mL塔瑪亞歷山大藻脅迫72-144 h，中國(guó)對(duì)蝦的肝胰腺、鰓和血淋巴的TLR和Relish基因表達(dá)或被顯著抑制(P<0.05)，或恢復(fù)至海水對(duì)照組的水平(P>0.05)。而1000 cells/mL藻中對(duì)蝦鰓組織和血淋巴

18、的上述基因表達(dá)在48-144 h被顯著抑制(P<0.05)，肝胰腺的表達(dá)在72-144 h被顯著抑制(P<0.05)。塔瑪亞歷山大藻脅迫下投喂感染W(wǎng)SSV的病蝦后，加藻的感染組(200和1000 cells/mL)和未加藻的感染組的中國(guó)對(duì)蝦雖然都在第3天時(shí)檢測(cè)到陽(yáng)性結(jié)果，7天內(nèi)累積死亡率均為100%，但同一時(shí)間點(diǎn)加藻組的累積死亡率高于未加藻組。塔瑪亞歷山大藻脅迫6天后的中國(guó)對(duì)蝦，經(jīng)鰻弧菌人工急性感染后，200和1000 cells/mL