赤潮藻亞歷山大藻LC3培養(yǎng)及谷氨酸銅對其滅除機制研究.pdf

1、近年來，赤潮在世界各地海域頻繁爆發(fā)，且規(guī)模不斷擴大，造成了巨大的經(jīng)濟損失，并危害了人類的生存環(huán)境。亞歷山大藻(Alexandrium)是一種全球分布的常見赤潮藻種，其屬下的30余種甲藻約一半為有毒種類，進行亞歷山大藻發(fā)生及防治的研究對于由其引發(fā)的赤潮的防治具有重要意義。 人們己對誘發(fā)亞歷山大藻赤潮發(fā)生的環(huán)境因子做了一些研究，這些研究多集中在營養(yǎng)鹽(氮、磷等)對亞歷山大藻增殖的影響上，隨著研究的深入，人們開始重視微量重金屬元素(鐵

2、、錳等)對藻增殖的影響。殺滅赤潮生物的主要方法有粘土法、化學藥劑法等。利用硫酸銅治理赤潮曾是國內(nèi)外長期采用的方法，但直接利用硫酸銅易造成局部濃度過高，進而對非赤潮生物及海洋生態(tài)環(huán)境產(chǎn)生不利影響。目前國際上公認的一種治理赤潮方法是撒播粘土法，在過去25年中，許多國家對其進行了研究。盡管粘土被人們視為是一種有效且有發(fā)展?jié)摿Φ目刂瞥喑狈椒?，但粘土的局部不適用、高昂的運輸費用以及短效性，使得這種方法的應用受到了限制。因此，尋找新型殺藻劑并研究其

3、殺藻效果及殺藻機制意義重大。 本研究以亞歷山大藻LC3為研究材料，對其發(fā)生赤潮條件進行初步研究，并利用電鏡技術(shù)、雙向電泳技術(shù)及質(zhì)譜技術(shù)對新型殺藻劑的殺藻機制進行研究。 (1)利用正交試驗研究氮、磷、鐵、錳四種物質(zhì)對亞歷山大藻LC3生長的影響，比較無機營養(yǎng)鹽及微量金屬元素對亞歷山大藻LC3增殖影響的大小順序。結(jié)果顯示，無機氮對藻的生長有促進作用，882～2646μmol/L濃度時亞歷山大藻LC3生長較好，2646μmol/

4、L下生長速率略快。無機磷對亞歷山大藻LC3生長的影響差異顯著，一定濃度的磷對LC3的生長有促進作用。鐵及錳對藻生長均有促進作用，分別在3.5μg/L的鐵濃度下及18～36μg/L的錳濃度下藻可獲得較快的生長速率。四種元素對亞歷山大藻LC3生長均有促進作用，各元素對生長影響的大小順序依次為：磷＞錳＞氮＞鐵。 (2)為尋找新型有效的殺藻劑，對辣椒素、過碳酸鈉、硫酸銅、谷氨酸銅對亞歷山大藻LC3的殺滅效果以及表面活性劑(HDTMAB)

5、對谷氨酸銅殺藻的促進作用進行研究。結(jié)果表明，辣椒素在較低濃度下(0.1，1.0，10.0mg/ml)對亞歷山大藻LC3無明顯殺滅作用，達到殺藻的目的所需辣椒素量較大；過碳酸鈉對亞歷山大藻LC3的殺滅率偏低，為此認為這兩種物質(zhì)均不適宜用于赤潮防治。谷氨酸銅可有效殺滅亞歷山大藻LC3，其對亞歷山大藻LC3的滅殺效率優(yōu)于硫酸銅，優(yōu)勢隨時間延長而明顯，但其對藻的抑制作用并不隨谷氨酸銅的濃度加大而增強。HDTMAB可有效促進谷氨酸銅殺滅亞歷山大藻

6、LC3，促進作用基本隨著HDTMAB濃度的提高而逐步增強。谷氨酸銅和HDTMAB復合劑可有效去除亞歷山大藻LC3，在赤潮治理中將具有較好的應用前景。 (3)借助掃描電子顯微鏡(SEM)和透射電子顯微鏡(TEM)，對谷氨酸銅、HDTMAB、硫酸銅以及谷氨酸銅-HDTMAB協(xié)同作用下亞歷山大藻LC3細胞形態(tài)及超微結(jié)構(gòu)的變化進行研究。結(jié)果表明，谷氨酸銅、HDTMAB、硫酸銅或協(xié)同脅迫下，藻的質(zhì)膜(細胞膜、葉綠體膜、線粒體膜等)完整性遭

7、到了破壞，這表明質(zhì)膜是這些脅迫物質(zhì)攻擊的目標。谷氨酸銅、HDTMAB等脅迫物嚴重破壞了葉綠體、線粒體等的結(jié)構(gòu)，這些變化直接影響了亞歷山大藻LC3的呼吸及光合作用，抑制了該藻的生長，甚至導致細胞死亡。銅離子脅迫下，亞歷山大藻LC3細胞內(nèi)淀粉顆粒、脂質(zhì)體等數(shù)量增加，在液泡、細胞核以及細胞膜等部位觀察到了不透明黑色沉淀，這些物質(zhì)可能與藻細胞解除金屬毒性有關(guān)。 (4)對谷氨酸銅對亞歷山大藻LC3細胞膜透性、丙二醛(MDA)及巰基含量的影

8、響進行研究，并比較谷氨酸銅和HDTMAB復合作用時，不同濃度表面活性劑作用下藻細胞膜脂過氧化水平、細胞膜功能狀態(tài)及巰基含量的變化，以對谷氨酸銅和HDTMAB殺滅赤潮藻的機制進行初步探討。結(jié)果表明，谷氨酸銅對亞歷山大藻LC3的殺滅主要靠銅離子的毒性作用，且谷氨酸可以增加銅離子穿透細胞膜的能力，0.5×10-3mol/L谷氨酸銅可促使藻細胞MDA含量與細胞質(zhì)膜透性明顯升高，使巰基含量下降，這表明谷氨酸銅殺滅赤潮藻的機制是使藻細胞膜受到損傷，

9、膜的透性增大，細胞內(nèi)物質(zhì)大量外滲，進而抑制藻細胞生長。HDTMAB可有效促進谷氨酸銅殺滅有害赤潮藻，其作用機理是由于與細胞膜結(jié)合，增加膜透性，使細胞膜功能受到破壞。谷氨酸銅、HDTMAB脅迫下，這些生理指標的變化驗證了透射電鏡觀察的結(jié)果，即谷氨酸銅、HDTMAB作用于亞歷山大藻LC3時攻擊質(zhì)膜，使質(zhì)膜遭到破壞的結(jié)論。 (5)用HDTMAB和Ca2+復合作用殺滅亞歷山大藻LC3，對Ca2+在HDTMAB殺滅亞歷山大藻LC3過程中的

10、作用進行初步研究。比較不同濃度Ca2+對HDTMAB殺滅亞歷山大藻LC3的影響，結(jié)果表明，Ca2+可明顯抑制HDTMAB對亞歷山大藻LC3的殺滅，濃度為4mmol/L時Ca2+對HDTMAB殺滅亞歷山大藻LC3的抑制效應最顯著。通過對Ca2+抑制HDTMAB殺滅亞歷山大藻LC3機制的初步探討發(fā)現(xiàn)，Ca2+及HDTMAB復合處理組與單純HDTMAB處理組相比，MDA含量降低，巰基含量升高，細胞質(zhì)膜透性減小。這表明，Ca2+對亞歷山大藻LC

11、3細胞抗HDTMAB脅迫的促進作用主要是通過穩(wěn)定細胞膜、降低細胞膜透性實現(xiàn)的。 (6)對亞歷山大藻LC3細胞蛋白質(zhì)提取純化及其雙向電泳技術(shù)進行研究。通過SDS-PAGE分析，發(fā)現(xiàn)其蛋白質(zhì)分子量主要集中于14～31kDa以及43～66kDa這兩個區(qū)域，其中尤以較低分子量的14～31kDa這一區(qū)間中的蛋白條帶最多。對雙向電泳蛋白樣品制備方法進行優(yōu)化，藻蛋白質(zhì)雙向電泳圖譜結(jié)果顯示，蛋白質(zhì)相對分子量約在14～100kDa范圍內(nèi)，主要分布

12、在14～31kDa之間，這與SDS-PAGE結(jié)果一致；蛋白質(zhì)的等電點分布在pH3.0～8.0的范圍內(nèi)，主要分布在酸性端的3.0～6.0范圍內(nèi)，采用pH3.0～5.6范圍的IPG預制膠條獲得了理想的分離效果，可分離出320個左右蛋白質(zhì)斑點，結(jié)合pH3.0～10.0以及pH3.0～5.6的IPG預制膠條，可較好的分離亞歷山大藻LC3蛋白質(zhì)。 (7)利用SDS-PAGE對HDTMAB促進谷氨酸銅殺滅亞歷山大藻LC3的機制進行進一步的研

13、究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，HDTMAB可造成藻蛋白表達量大幅降低，與對照組及單純谷氨酸銅處理組相比，蛋白條帶較少。利用SDS-PAGE及2-DE對谷氨酸銅殺滅亞歷山大藻LC3的機制進行進一步的研究，結(jié)果顯示，谷氨酸銅作用造成分子量大于31kDa的蛋白表達量大幅降低，但谷氨酸銅處理也誘導了一些低分子量蛋白質(zhì)的合成，這些低分子量蛋白可能是藻細胞在逆境脅迫下的一種自我保護。本節(jié)實驗結(jié)果顯示，谷氨酸銅殺滅亞歷山大藻LC3及HDTMAB促進殺滅的另一機制為：

14、造成藻細胞內(nèi)的部分蛋白質(zhì)變性和解體，進而抑制藻細胞生長。 (8)對3個谷氨酸銅脅迫下亞歷山大藻LC3雙向電泳圖譜上的差異蛋白點，用基質(zhì)輔助激光解析/電離飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)進行肽質(zhì)量指紋圖譜分析，并通過數(shù)據(jù)庫檢索進行蛋白質(zhì)的鑒定。分析比較數(shù)據(jù)庫的檢索結(jié)果，篩選最合適匹配的記錄，發(fā)現(xiàn)1號蛋白與一種共生甲藻(Symbiodiniumsp.)的Ⅱ型1，5-二磷酸核酮糖羧化酶(Rubisco)的前體(大亞基)匹配最好

15、；2號蛋白與單細胞綠色鞭毛植物(Mesostigmaviride)的RNA聚合酶β亞基匹配最好；3號蛋白則與一種紅藻(Guillardiatheta)的一種未知功能的蛋白最相似。1、2號蛋白均為在對照處理組中表達而在谷氨酸銅脅迫下受抑制的蛋白。造成谷氨酸銅脅迫下Rubisco(1號蛋白)表達缺失的原因主要有三方面：(1)谷氨酸銅脅迫造成的Rubisco的氧化修飾使Rubisco降解成無活性的小片段；(2)葉綠體結(jié)構(gòu)遭破壞，促進了谷氨酸銅

16、對Rubisco合成的抑制；(3)Rubisco作為胞內(nèi)重要儲藏蛋白發(fā)生降解，這可能是細胞對脅迫的一種自主反應。氧化修飾及葉綠體結(jié)構(gòu)遭破壞也是RNA聚合酶(2號蛋白)受抑制的原因。3號蛋白是亞歷山大藻LC3在谷氨酸銅脅迫下生成的新蛋白，這可能是藻細胞在逆境脅迫下的一種自我保護。 綜上所述，谷氨酸銅對亞歷山大藻LC3具有較強的滅除作用，其殺滅赤潮藻效率優(yōu)于硫酸銅。HDTMAB可有效促進谷氨酸銅殺滅有害赤潮藻，且促進作用基本隨著HD

17、TMAB濃度的提高而同步增強。對谷氨酸銅及HDTMAB等脅迫下，亞歷山大藻LC3在細胞生理活性(膜透性、MDA及巰基含量)、形態(tài)及超微結(jié)構(gòu)等方面均發(fā)生了顯著變化，這些變化說明，谷氨酸銅和HDTMAB通過破壞細胞膜來抑制藻的生長。利用2-DE及質(zhì)譜技術(shù)對脅迫條件下的蛋白變化進行的研究表明，谷氨酸銅可造成藻細胞內(nèi)的部分蛋白質(zhì)變性和解體，進而抑制藻細胞生長。谷氨酸銅殺藻的機制可以歸結(jié)為兩點：(1)使藻質(zhì)膜受到損傷；(2)造成藻細胞內(nèi)的部分蛋白