血管基膜衍生多功能肽高效工程菌的構(gòu)建及人肺癌裸鼠移植瘤模型治療實驗.pdf

1、研究背景：本文采用整合抑制腫瘤血管生成和抑制腫瘤細胞增殖策略，將腫瘤抑素(tumstatin)N端74-98氨基酸功能肽通過人IgG3上游鉸鏈區(qū)序列與tumstatinN端197-215氨基酸功能肽連接，獲得了一種全新的同時具有抑制血管內(nèi)皮細胞增殖和抑制腫瘤細胞增殖兩種不同抗腫瘤特性的血管基膜衍生多功能肽(Vascularbasementmembrane-derivedmultifunctionalpeptide，VBMDMP)。本課題

2、是在此基礎(chǔ)上構(gòu)建重組VBMDMP同型四聚體可溶性融合蛋白高豐度原核表達質(zhì)粒pETSUMO-4VBMDMP，轉(zhuǎn)化入BL21(ED3)大腸桿菌獲得重組VBMDMP高效工程菌；通過重組VBMDMP裸鼠人肺癌異種移植瘤模型治療實驗評價重組VBMDMP治療腫瘤的有效性.為重組VBMDMP產(chǎn)業(yè)化奠定基礎(chǔ). 方法：將原pUC19-VBMDMP和pUC19質(zhì)粒分別用HindⅢ和KpnⅠ酶切獲得VBMDMPcDNA片段和pUC19cDNA片段，將

3、兩者連接后得到新單聚體pUC19-VBMDMP；酶切圖譜和測序鑒定后，將新單聚體pUC19-VBMDMP用BamHⅠ和EcoRⅠ酶切獲得VBMDMPcDNA片段，用BclⅠ和EcoRⅠ酶切獲得載體cDNA片段，將分別獲得的兩個片斷連接得到pUC19-2VBMDMP，重復(fù)以上步驟得pUC19-4VBMDMP；分別酶切圖譜和測序鑒定pUC19-2VBMDMP和pUC19-4VBMDMP。測序后以pUC19-4VBMDMP為模板，T/A克隆構(gòu)

4、建重組pETSUMO-4VBMDMP。重組pETSUMO-4VBMDMP原核表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入BL21(ED3)大腸桿菌，IPTG誘導(dǎo)表達4小時，鎳親和層析柱分離純化，得重組4VBMDMP融合蛋白。同時，用針對tumstatinN端197-215氨基酸功能肽的多克隆抗體，Westernblot分析對重組4VBMDMP進行免疫鑒定。BCA法分別測定pETSUMO-4VBMDMP轉(zhuǎn)化的BL21(ED3)大腸桿菌裂解液和鎳親和層析后獲取的等容積洗

5、脫液蛋白質(zhì)含量，評價pETSUMO-4VBMDMP轉(zhuǎn)化的BL21(ED3)大腸桿菌生產(chǎn)重組VBMDMP的效率。最后應(yīng)用裸鼠人肺癌異種移植瘤模型治療實驗鑒定重組VBMDMP抗腫瘤活性?！　〗Y(jié)果： (1)VBMDMP單聚體，二聚體，四聚體的PCR產(chǎn)物和新單聚體pUC19-VBMDMP、pUC19-2VBMDMP、pUC19-4VBMDMP經(jīng)酶切圖譜和測序分析其序列與設(shè)計序列完全一致。　　(2)pETSUMO-4VBMDMP轉(zhuǎn)化的

6、BL21(DE3)大腸桿菌，IPTG誘導(dǎo)4小時，細胞裂解液和鎳親和層析柱洗脫液SDS-PAGE和Westernbolt顯示43KD的目的條帶，即重組4VBMDMP?！　?3)pETSUMO-4VBMDMP轉(zhuǎn)化的BL21(DE3)大腸桿菌裂解液所含總蛋白量為5.45mg/ml，而鎳親和層析柱洗脫液重組4VBMDMP蛋白含量為2.56mg/ml，該轉(zhuǎn)化菌表達豐度為47％；該轉(zhuǎn)化菌的生產(chǎn)效率是原pGEX-4T-1-VBMDMP轉(zhuǎn)化JM109

7、大腸桿菌生產(chǎn)效率的9.8倍?！　?4)在裸鼠人肺癌異種移植瘤模型治療實驗中，重組VBMDMP(1mg/kg，5mg/kg)的腫瘤生長抑制率分別是42％和74％，瘤重抑制率分別是42％和77％；其效價強度是常規(guī)化療藥環(huán)磷酰胺的20倍。這些結(jié)果表明重組VBMDMP對裸鼠人肺癌異種移植瘤生長具有顯著抑制作用。　　結(jié)論：　　(1)成功地構(gòu)建重組VBMDMP同型四聚體可溶性融合蛋白高豐度原核表達質(zhì)粒pETSUMO-4VBMDMP。　　(2