在氨基酸反應(yīng)中探討左旋門冬酰胺酶殺傷MOLT-4細(xì)胞的機(jī)制.pdf

1、目的：
　　 左旋門冬酰胺酶(L-asparaginase，L-asp)是治療兒童急性淋巴細(xì)胞白血病(Acute lymphocytic leukemia，ALL)的重要化療藥物之一。單獨(dú)使用L-asp可以使兒童ALL的完全緩解率達(dá)到40％-60％。其作用機(jī)制如下：它可以水解血液/培養(yǎng)液中的門冬酰胺，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)的門冬酰胺水平降低，令細(xì)胞蛋白質(zhì)合成受阻，細(xì)胞趨于凋亡。盡管L-asp是一種歷時(shí)彌久的老藥，但其殺傷細(xì)胞的具體分子機(jī)制仍

2、不清楚。
　　 本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)T淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞系MOLT-4進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)，研究L-asp對(duì)MOLT-4細(xì)胞的增殖抑制作用，并觀察ASNS、CHOP、Bax及Bcl2mRNA在L-asp作用后不同時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)情況，從中探討可能存在的凋亡機(jī)制。這在國內(nèi)外文獻(xiàn)未見報(bào)道，本研究將為L-asp的作用機(jī)制提供新的理論依據(jù)。
　　 方法：
　　 一、細(xì)胞培養(yǎng)及胎盼蘭拒染法檢測細(xì)胞存活率
　　 將MOLT-4細(xì)胞進(jìn)行復(fù)

3、蘇培養(yǎng)，急性T淋巴細(xì)胞白血病MOLT-4細(xì)胞株，置于含10%胎牛血清，100IU/ml青霉素，100mg/ml鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)液中，在37℃、5％CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，每2d至3d傳代1次。取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞，接種至6孔培養(yǎng)板，細(xì)胞濃度為5×105/ml。培養(yǎng)24h后實(shí)驗(yàn)分組如下：1.對(duì)照組(細(xì)胞培養(yǎng)液中不加任何藥物)；2.實(shí)驗(yàn)組：用1IU/mlL-asp處理。實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組分別于加藥處理后的12h，18h，24h，4

4、8h，96h計(jì)數(shù)活細(xì)胞數(shù)。計(jì)數(shù)時(shí)先制備細(xì)胞懸液，用0.2％臺(tái)盼藍(lán)染色以判定細(xì)胞活性(活細(xì)胞不著色)，取少量細(xì)胞懸液滴于細(xì)胞計(jì)數(shù)板上，顯微鏡下計(jì)數(shù)。
　　 二、實(shí)時(shí)定量熒光PCR
　　 分別收集用1IU/ml的L-asp處理后的MOLT-4細(xì)胞，提取總RNA，按試劑盒說明書配置逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系合成cDNA；引物由Takara公司設(shè)計(jì)合成，采用SYBRGreenⅠ實(shí)時(shí)定量熒光PCR方法，以GAPDH為內(nèi)參照，進(jìn)行SYRBGre

5、enⅠ實(shí)時(shí)熒光定量PCR，檢測ASNS、CHOP、Bax及Bcl2mRNA表達(dá)水平。
　　 三、結(jié)果判斷
　　 將標(biāo)準(zhǔn)品cDNA10倍濃度梯度稀釋為5-6個(gè)濃度梯度，各取2μL作為模板進(jìn)行RealTime PCR反應(yīng)，由各擴(kuò)增曲線得到的CT值制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，從而得到樣本的拷貝數(shù)。以GAPDH作為內(nèi)參照，CHOP，ASNS，Bcl2及Bax作為目的基因，通過目的基因和內(nèi)參基因拷貝數(shù)的比值進(jìn)行樣本間相對(duì)定量的比較。
　　

6、 四、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
　　 采用SAS(SAS for Windows，9.2版本)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果用(x-±s)表示，應(yīng)用Wilcoxon-Mann-Whitney檢驗(yàn)考察目的基因的相對(duì)mRNA表達(dá)水平在不同的時(shí)間點(diǎn)的差異表達(dá)情況。
　　 結(jié)果：
　　 一、方法的可靠性和準(zhǔn)確性
　　 1、RNA的純度和質(zhì)量分析
　　 所提取的總RNA經(jīng)紫外分光光度計(jì)檢測，比值在1.8-2.0之間，經(jīng)瓊脂

7、糖凝膠電泳鑒定，條帶清晰可見，無明顯降解。
　　 2、擴(kuò)增的特異性及定量的準(zhǔn)確性
　　 標(biāo)準(zhǔn)品cDNA經(jīng)梯度稀釋后進(jìn)行PCR反應(yīng)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)(r2)均>0.998，斜率在-3.3至-3.5之間，反映定量準(zhǔn)確，擴(kuò)增效率良好。擴(kuò)增后溶解曲線顯示銳利的單一鋒，無其他非特異性鋒，說明擴(kuò)增產(chǎn)物均一，無非特異擴(kuò)增及引物二聚體。瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)一步驗(yàn)證擴(kuò)增片段的均一性及長度。
　　 二、1IU/mlL

8、-asp對(duì)MOLT-4細(xì)胞增殖的影響
　　 1Iu/mlL-asp作用于MOLT-4細(xì)胞的0-96h內(nèi)，在不同時(shí)間點(diǎn)測得的細(xì)胞存活率與細(xì)胞存活數(shù)。18h之前實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組的細(xì)胞存活率無顯著差異(P>0.05)，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞存活數(shù)自24h后開始顯著下降(與18h及48h相比較，P<0.05)，72h時(shí)細(xì)胞幾乎全部死亡；實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組的細(xì)胞存活率在0-12h內(nèi)差異不顯著(P>0.05)，自18h開始實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞存活率顯著下降(L-asp

9、作用后的18h與12h及24h相比較，P<0.05)。
　　 三、L-asp對(duì)MOLT-4細(xì)胞CHOP，ASNS，Bcl2及BaxmRNA表達(dá)的影響
　　 在L-asp用藥后的8h和18hCHOP與ASNSmRNA出現(xiàn)兩次表達(dá)高峰，18h后CHOPmRNA水平仍維持在較高水平，ASNSmRNA開始逐漸下降；Bax/Bcl2比值也于18h后顯著升高。
　　 結(jié)論：
　　 左旋門冬酰胺酶殺傷MOLT-4細(xì)胞可