念珠菌在HIV感染者口腔的檢出及毒力研究.pdf

1、艾滋病是獲得性免疫缺陷綜合征（acquired immunodeficiency syndrome，AIDS）的簡稱，是由人類免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）感染所引起的一組以嚴(yán)重細(xì)胞免疫功能缺陷為特征，并由此導(dǎo)致各種條件性感染或腫瘤的疾病。HIV主要侵犯、破壞CD4+淋巴細(xì)胞，使機(jī)體細(xì)胞免疫功能受損，最終并發(fā)各種嚴(yán)重的機(jī)會(huì)性感染和腫瘤而導(dǎo)致死亡。自1985年我國發(fā)現(xiàn)首例HIV感染者以來，

2、HIV/AIDS在我國的傳播呈快速增長的趨勢，截至2007年底我國HIV感染者和AIDS患者約有70萬人，全人群感染率為0.05%。 皮膚、粘膜是HIV侵襲的主要部位之一，有文獻(xiàn)報(bào)道AIDS相關(guān)的皮膚黏膜病變的發(fā)生率為66.7%～90.0%[2]。其中30%～80%的HIV感染者存在口腔損害，主要的口腔相關(guān)病變有：口腔念珠菌?。╫ral candidiasis，OC）、毛狀白斑（Hairy Leukoplasia，HL）、Kap

3、osi肉瘤（Kaposi's Sarcoma，KS）、非霍杰金淋巴瘤（non-Hodgkin's Lymphoma，NHL）、口腔皰疹、艾滋病相關(guān)牙周病、潰瘍性疾病等。其中口腔念珠菌病在HIV感染者的口腔損害中最為常見，發(fā)病率為20.16%～56.00%。它是HIV感染者免疫抑制的早期征象，被視為發(fā)現(xiàn)和診斷AIDS的一項(xiàng)重要指征。 目前國內(nèi)對于HIV感染者口腔念珠菌的檢出率及菌群分布的相關(guān)研究及數(shù)據(jù)還相當(dāng)少，因此，本研究選擇各8

4、2例HIV感染者及健康人，進(jìn)行了口腔念珠菌的檢出率及菌種分布的研究，同時(shí)選擇其中的部分菌株做進(jìn)一步相關(guān)毒力的研究，以期為HIV感染者口腔念珠菌病的預(yù)防和臨床治療提供線索和積累資料。 第一章 HIV感染者口腔念珠菌檢出率及菌種分布。 1.目的： 采集HIV感染者的口腔含漱液，進(jìn)行接種培養(yǎng)，研究HIV感染者口腔念珠菌的檢出率及檢出的菌株種類。 2.方法： 采集82例HIV感染者含漱液樣本，并接種培養(yǎng)于

5、沙保瓊脂培養(yǎng)基，通過形態(tài)學(xué)、染色性、念珠菌CHROMagar顯色培養(yǎng)基鑒定、45℃生長試驗(yàn)、玉米吐溫80瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)、念珠菌API20 C AUX鑒定等方法將念珠菌鑒定到種。 3.結(jié)果： 本組82例HIV感染者的口腔含漱液中，有60例可培養(yǎng)出念珠菌，檢出率為73.17%。在60例念珠菌檢出者中，有70%（42/60）可分離出白色念珠菌，73.33%（44/60）可分離出光滑念珠菌，1.67%（1/60）可分離出熱帶念珠

6、菌，3.33%（2/60）可分離出近平滑念珠菌，1.67%（1/60）可分離出菌膜念珠菌。在60例念珠菌檢出者中，有51.67%（31/60）例菌種共存的情況，其中同時(shí)分離出白色念珠菌和光滑念珠菌的有29例。 本章實(shí)驗(yàn)共分離出211株念珠菌，其中光滑念珠菌103株，白色念珠菌95株，熱帶念珠菌4株，近平滑念珠菌4株，菌膜念珠菌2株，其他3株。 第二章健康對照人群口腔念珠菌檢出率及菌種分布。 1.目的： 采

7、集按年齡，性別配對原則納入研究的健康人的口腔含漱液，進(jìn)行接種培養(yǎng)，比較健康人群和HIV感染者口腔念珠菌的檢出率及檢出的菌株種類差異。 2.方法： 采集82例性別、年齡均與HIV感染者配對的健康人的口腔含漱液，接種培養(yǎng)于沙保瓊脂培養(yǎng)基，通過形態(tài)學(xué)、染色性及念珠菌CHROMagar鑒定、45℃生長試驗(yàn)、玉米吐溫80瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)、念珠菌API20 C AUX鑒定等將念珠菌鑒定到種。 3.結(jié)果： 本組82例健康

8、人的口腔含漱液中，有17例可培養(yǎng)出念珠菌，檢出率為20.73%。在17例念珠菌檢出者中，有64.71%（11/17）可檢出白色念珠菌，29.41%（5/17）可檢出近平滑念珠菌。 17例生長念珠菌的樣本共分離出31株念珠菌，其中白色念珠菌15株，近平滑念珠菌12株，其他4株。 統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果表明，HIV感染者的念珠菌檢出率高于健康對照組（P<0.01），在兩組念珠菌檢出陽性人群中HIV感染者的白色念珠菌的檢出率與健康對照組的

9、差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），HIV感染者的光滑念珠菌的檢出率高于健康對照組（P<0.01），健康對照組的近平滑念珠菌的檢出率高于HIV感染者（P<0.01）。 第三章 HIV感染者及健康人群口腔念珠菌臨床分離株毒力的體外實(shí)驗(yàn)。 1.目的： 選取24株念珠菌臨床分離株做念珠菌相關(guān)毒力的研究，包括檢測其對頰黏膜上皮細(xì)胞的黏附性、磷脂酶活性及溶血性。 2.方法： 選取24株念珠菌臨床分離株，其中H

10、IV感染者的選擇對象為CD4+細(xì)胞計(jì)數(shù)<100/mm3，并分為以下3組。A組為8株分離自HIV感染者的白色念珠菌；B組為8株分離自HIV感染者的光滑念珠菌；C組為8株分離自健康對照組的白色念珠菌。將-70℃保存的念珠菌臨床株接種到沙保瓊脂培養(yǎng)基上復(fù)蘇，37℃，18～24 h。 （1）念珠菌對頰黏膜上皮細(xì)胞的黏附性實(shí)驗(yàn) 將0.5ml頰黏膜上皮細(xì)胞和0.5ml念珠菌懸液混勻，水浴振蕩，微孔濾膜過濾。PBS沖洗，置載玻片10s

11、，革蘭染色。計(jì)算每一菌株在頰黏膜上皮細(xì)胞的平均黏附數(shù)（每100個(gè)頰細(xì)胞上黏附的念珠菌個(gè)數(shù)），定義為H值。 （2）蛋黃平皿法測定念珠菌的磷脂酶活性 將10μl菌懸液滴于蛋黃培養(yǎng)基表面，37℃培養(yǎng)48 h后觀察結(jié)果。結(jié)果測定：磷脂酶陽性的菌株在蛋黃培養(yǎng)基上的菌落周圍會(huì)形成一個(gè)與菌落共圓心的沉淀圈（環(huán)），測量菌落直徑和沉淀圈直徑。用Pz值表示酶的活力，Pz值=菌落直徑/沉淀圈直徑。 （3）溶血性的測定 將10μ

12、l菌懸液滴于濃縮羊血培養(yǎng)基上，37℃、5%CO2培養(yǎng)48h。用透射光觀察菌落周圍，如果可觀察到半透明的與菌落共圓心相同的暈圈（環(huán)）存在，則表示溶血性陽性。測量菌落直徑和溶血環(huán)暈圈直徑并計(jì)算溶血指數(shù)：溶血指數(shù)=菌落直徑/溶血環(huán)暈圈直徑。 3.結(jié)果： 3組念珠菌的H值差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=6.182，P<0.01）。進(jìn)一步作各組念珠菌H值兩兩比較，結(jié)果為：HIV感染者的白色念珠菌和健康對照組的白色念珠菌的H值差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意

13、義（P>0.05），HIV感染者的白色念珠菌與光滑念珠菌的H值差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），健康對照組的白色念珠菌與HIV感染者的光滑念珠菌的H值差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。即HIV感染者與健康對照組的口腔白色念珠菌臨床分離株對頰黏膜上皮細(xì)胞的黏附性沒有差異，但兩者均高于分離于HIV感染者口腔的光滑念珠菌的黏附性。 3組念珠菌的Pz值差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=25.562，P<0.01）。進(jìn)一步作各組念珠菌Pz值兩兩比較，

14、結(jié)果為：HIV感染者的白色念珠菌和健康對照組的白色念珠菌的Pz值差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），HIV感染者的白色念珠菌與光滑念珠菌的Pz值差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），健康對照組的白色念珠菌與HIV感染者的光滑念珠菌的Pz值差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。即HIV感染者與健康對照組的口腔白色念珠菌臨床分離株的磷脂酶活性沒有差異，但兩者均高于HIV感染者口腔光滑念珠菌的磷脂酶活性。 所有檢測菌株的溶血性均為陽性。HIV

15、感染者口腔白色念珠菌、健康對照組口腔白色念珠菌、HIV感染者口腔光滑念珠菌臨床分離株這3組的溶血指數(shù)差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=0.284，P>0.05）。 全文結(jié)論： 1.HIV感染者口腔念珠菌的檢出率為73.17%，主要菌種是白色念珠菌和光滑念珠菌，兩者可單獨(dú)檢出或共存。 2.健康對照組口腔念珠菌的檢出率為20.73%，主要菌種是白色念珠菌和近平滑念珠菌。HIV感染者的總的念珠菌檢出率高于健康對照組，兩組念珠菌檢

16、出陽性人群中HIV感染者光滑念珠菌的檢出率亦高于健康對照組，而HIV感染者的白色念珠菌的檢出率與健康對照組沒有區(qū)別。鑒于HIV感染者較健康人群更易發(fā)生口腔念珠菌感染，提示口腔念珠菌的增加是HIV感染者較健康人群更易感口腔念珠菌病的風(fēng)險(xiǎn)因子。 3.HIV感染者與健康對照組相比，口腔白色念珠菌的毒力沒有差異，而HIV感染者的光滑念珠菌的毒力低于HIV感染者和健康對照組的白色念珠菌，結(jié)合光滑念珠菌在兩組人群中的檢出率差異結(jié)果，說明健康