蛋白質(zhì)質(zhì)譜高通量分析平臺(tái)的建立及其在子宮內(nèi)膜異位癥中的應(yīng)用性研究.pdf

1、盆腔子宮內(nèi)膜異位癥(endometriosis, EM)是一種常見的婦女良性疾病，指異位子宮內(nèi)膜累及盆腔腹膜及（或）盆腔內(nèi)生殖器的病變，即子宮內(nèi)膜腺體及間質(zhì)細(xì)胞生長在子宮腔以外的部位，這種組織學(xué)上完全良性的內(nèi)膜組織可像惡性腫瘤一樣增生、浸潤、擴(kuò)散與轉(zhuǎn)移，引起相應(yīng)的臨床癥狀。其常見的癥狀包括：痛經(jīng)，性交痛，不孕，腸道或泌尿道癥狀（排便困難、腹瀉、便秘、甚至周期性便血、尿頻、血尿等）等，嚴(yán)重影響育齡期女性的生活質(zhì)量和健康。子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)

2、病機(jī)制至今仍不清楚，目前尚無有效的早期篩查和特異的診斷方法。如何提高子宮內(nèi)膜異位癥的診斷率尤其是早期診斷率已被公認(rèn)為是改善其療效和預(yù)后的關(guān)鍵。若能提高早期子宮內(nèi)膜異位癥的診斷率，即可明顯提高子宮內(nèi)膜異位癥的總體治療效果。因此，在無癥狀人群中用非侵入性手段篩檢子宮內(nèi)膜異位癥，達(dá)到早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療，是子宮內(nèi)膜異位癥的重要防治策略之一。由于是蛋白質(zhì)并不是核酸方為生命活動(dòng)具體的執(zhí)行者和體現(xiàn)者，因此，深入研究子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)病機(jī)制，尋找特

3、異性、靈敏性均佳的生物標(biāo)志物用于診斷，尤其是早期診斷，客觀上要求在蛋白質(zhì)組的水平上進(jìn)行深入的探索。表面加強(qiáng)激光解吸電離-飛行時(shí)間質(zhì)譜(surface-enhanced laser desorpTiO2/ ionizaTiO2 time-of-flight mass spectrometry, SELDI-TOF-MS)是近年來發(fā)展起來的一種全新的蛋白質(zhì)組學(xué)的研究手段，該方法相對(duì)其他傳統(tǒng)的蛋白質(zhì)組學(xué)研究方法而言，具有能直接對(duì)臨床的標(biāo)本進(jìn)行

4、檢測(cè)，實(shí)現(xiàn)了高通量的質(zhì)譜技術(shù)應(yīng)用于臨床樣本檢測(cè)的優(yōu)點(diǎn)。生命科學(xué)的快速發(fā)展使人們從基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)等研究領(lǐng)域中獲得了大量的數(shù)據(jù)，僅依靠傳統(tǒng)的統(tǒng)計(jì)手段是無法處理這些數(shù)據(jù)的，生物信息學(xué)的發(fā)展更是為收集、存儲(chǔ)以及分析這些數(shù)據(jù)，并且從中獲取有用的生物學(xué)信息提供了重要的手段。課題旨在應(yīng)用SELDI蛋白質(zhì)指紋圖譜和生物信息學(xué)技術(shù)從血清、在位子宮內(nèi)膜、腹水中篩選子宮內(nèi)膜異位癥的生物標(biāo)志物并分別構(gòu)建子宮內(nèi)膜異位癥的血清、在位子宮內(nèi)膜、腹腔液診斷模型，

5、為探索子宮內(nèi)膜異位癥發(fā)病機(jī)制提供新思路。
　　 第一部分：子宮內(nèi)膜異位癥患者血清蛋白質(zhì)指紋圖譜模型的臨床意義
　　 用SELDI-TOF-MS技術(shù)和H4蛋白芯片檢測(cè)36例子宮內(nèi)膜異位癥和30例正常女性的血清蛋白質(zhì)指紋圖譜，隨機(jī)抽取其中2/3的血清標(biāo)本（24例子宮內(nèi)膜異位癥和20例正常女性血清標(biāo)本）作為訓(xùn)練組，并建立診斷模型。然后，將余下的1/3的血清標(biāo)本（12例子宮內(nèi)膜異位癥患者樣本和10名健康人血清標(biāo)本）作為實(shí)驗(yàn)組，進(jìn)

6、行交叉驗(yàn)證該模型。篩選出5個(gè)有明顯表達(dá)差異的蛋白，其質(zhì)荷比(m/z)分別為8142、5640、5847、8940和3269。我們建立的診斷模型對(duì)子宮內(nèi)膜異位癥檢測(cè)的靈敏度為91.7％(11/12)，特異性為90.0％(9/10)，總準(zhǔn)確率為90.9％(20/22)。
　　 第二部分：子宮內(nèi)膜異位癥血清蛋白質(zhì)質(zhì)譜標(biāo)準(zhǔn)化分析平臺(tái)的驗(yàn)證
　　 本研究在第一部分的36例子宮內(nèi)膜異位癥患者血清標(biāo)本中隨機(jī)抽選16例作為研究對(duì)象，3個(gè)

7、月后用H4蛋白質(zhì)芯片對(duì)上述16例子宮內(nèi)膜異位癥樣本和16例健康志愿者總共32份血清標(biāo)本再次進(jìn)行檢測(cè)，本研究嚴(yán)格按照第一部分的血清蛋白質(zhì)質(zhì)譜標(biāo)準(zhǔn)化實(shí)驗(yàn)方法。將前后兩次結(jié)果進(jìn)行對(duì)比，分析，比較兩次不同時(shí)間實(shí)驗(yàn)選擇的作為診斷模型的蛋白質(zhì)峰的值，結(jié)果發(fā)現(xiàn)統(tǒng)計(jì)差異顯著的峰在兩次不同時(shí)間檢測(cè)中都仍然差異顯著，能夠重復(fù)出來，而且各個(gè)不同的峰在兩次不同時(shí)間的檢測(cè)中在子宮內(nèi)膜異位癥患者和健康人血清中表達(dá)高低也能夠重復(fù)，驗(yàn)證了子宮內(nèi)膜異位癥血清診斷模型的有

8、效性。
　　 第三部分：子宮內(nèi)膜異位癥患者在位子宮內(nèi)膜指紋圖譜模型的臨床意義
　　 用SELDI-TOF-MS技術(shù)和H4蛋白芯片檢測(cè)13例子宮內(nèi)膜異位癥和13例良性婦科疾病并排除子宮內(nèi)膜異位癥的患者的在位子宮內(nèi)膜組織蛋白質(zhì)指紋圖譜，我們優(yōu)化選擇了5個(gè)蛋白質(zhì)荷比峰作子宮內(nèi)膜異位癥在位內(nèi)膜的診斷模型：6898 m/z、5891 m/z、5385 m/z、6448 m/z和5425 m/z。其中6898 m/z、5891 m/

9、z和6448 m/z的3個(gè)峰在子宮內(nèi)膜異位癥患者在位內(nèi)膜中表達(dá)高于對(duì)照組在位內(nèi)膜；而5385 m/z和5425 m/z的2個(gè)蛋白質(zhì)峰在子宮內(nèi)膜異位癥患者在位內(nèi)膜中表達(dá)則低于對(duì)照組在位內(nèi)膜。
　　 第四部分：子宮內(nèi)膜異位癥患者腹水指紋圖譜模型的臨床意義
　　 用SELDI-TOF-MS技術(shù)和H4蛋白芯片檢測(cè)14例子宮內(nèi)膜異位癥和16例對(duì)照組的腹水蛋白質(zhì)指紋圖譜，我們優(yōu)化選擇了4個(gè)蛋白質(zhì)荷比峰作子宮內(nèi)膜異位癥腹水的診斷模型：

10、4428 m/z、6891 m/z13766 m/z和6427 m/z。其中4428 m/z、6427 m/z的2個(gè)峰在子宮內(nèi)膜異位癥患者腹水中高表達(dá)；13766 m/z和6891 m/z的2個(gè)蛋白質(zhì)峰在子宮內(nèi)膜異位癥患者腹水中則低表達(dá)。
　　 結(jié)論：
　　 5個(gè)蛋白質(zhì)峰8142 m/z、5640 m/z、5847 m/z、8940 m/z和3269 m/z組合所構(gòu)建的血清診斷模型鑒別子宮內(nèi)膜異位癥和健康志愿者的總準(zhǔn)確率

11、為90.9％(20/22)。其中5640 m/z、5847 m/z、和3269 m/z的3個(gè)峰在子宮內(nèi)膜異位癥患者血清中高表達(dá)；8142 m/z和8940 m/z的2個(gè)蛋白質(zhì)峰在子宮內(nèi)膜異位癥患者血清中則低表達(dá)。
　　 本研究建立的的標(biāo)準(zhǔn)方法建立的模型在樣本的不同時(shí)間上有效性和重復(fù)性均得到了驗(yàn)證。
　　 5個(gè)蛋白質(zhì)峰6898 m/z、5891 m/z、5385 m/z、6448 m/z和5425 m/z組合構(gòu)建了子宮內(nèi)膜

12、異位癥的在位子宮內(nèi)膜的診斷模型。其中6898 m/z、5891 m/z和6448 m/z在子宮內(nèi)膜異位癥中高表達(dá),5385 m/z和5425 m/z在子宮內(nèi)膜異位癥中低表達(dá)。
　　 4個(gè)蛋白質(zhì)峰4428 m/z、6891 m/z13766 m/z和6427 m/z組合構(gòu)建了子宮內(nèi)膜異位癥的腹水的診斷模型。其中4428m/z、6891m/z在子宮內(nèi)膜異位癥腹水中高表達(dá)，13766 m/z和6427 m/z在子宮內(nèi)膜異位癥腹水中低表