蟲草核苷類成分檢測方法的建立與蟲草多糖組成分析.pdf

1、蟲草是一種重要的藥用資源，但對生長環(huán)境要求苛刻，產(chǎn)量相對較低，因此價格昂貴。近年來，諸多學者嘗試人工培植蟲草或發(fā)酵蟲草菌以獲得相應的蟲草產(chǎn)品來緩解蟲草資源供不應求的局面。蟲草及蟲草產(chǎn)品種類繁多，故其質(zhì)量的準確評價及有效成分的含量測定成為關(guān)鍵。本研究通過高效液相色譜、紅外光譜等手段對蟲草中核苷類及多糖成分進行分析，以期建立蟲草有關(guān)成分的標準化檢測方法;通過響應面法對蟲草菌產(chǎn)多糖液體發(fā)酵培養(yǎng)基進行優(yōu)化，以提高蟲草多糖的產(chǎn)量。因此，本研究旨在

2、對蟲草資源的全面評價及進一步開發(fā)提供一定的理論依據(jù)。本文主要研究結(jié)果如下:
　　1、通過提取方法的比較和正交試驗確定了蟲草核苷類成分的最佳提取方法為超聲提取法，最佳提取工藝為:以超純水為提取溶劑，料液比為1∶50，常溫超聲提取30min。確定了蟲草核苷類成分的檢測方法，使用中科安泰C18(250mm×4.6mm，5μm)色譜柱，最佳色譜條件為:檢測波長:260nm;流動相為A（甲醇）-B（水）二元梯度洗脫，洗脫程序為:0～10mi

3、n，5％→10％A;10～20min，5％→20％A;20～35min，20％→10％A;35～40min，10％→5％A;流速:0.5mL/min;進樣量:10μL;柱溫:25℃;檢測時間:40min;進樣間隔:5min。經(jīng)方法學驗證，該方法線性關(guān)系良好、精密度高，適用性、重復性、加樣回收率均符合2015版藥典要求。
　　2、對蟲草及發(fā)酵蟲草菌粉中核苷類成分進行測定與比較，結(jié)果顯示冬蟲夏草蟲體中所含的核苷類成分種類最多，但蟲草素

4、未檢出;人工蛹蟲草子實體中腺苷、尿苷、胸苷含量相對較高，蟲草素含量高達3265.88μg/g;冬蟲夏草菌CC-9發(fā)酵菌絲體中檢出了5種核苷類成分，其中尿嘧啶和胸苷含量相對較高;冬蟲夏草菌CC-10發(fā)酵菌絲體中蟲草素未檢出，但含有的核苷類成分種類較多且含量較高，檢出肌苷含量為158.24μg/g，而在其他菌絲體中未檢出;蛹蟲草YC-1發(fā)酵菌絲體中蟲草素含量為193.97μg/g，是本試驗唯一檢出蟲草素的菌株，尿苷、鳥苷和腺苷含量均較高;蛹

5、蟲草YC-2發(fā)酵菌絲體中尿苷、鳥苷和腺苷含量最高，分別為4641.64μg/g、4214.05μg/g、2460.03μg/g，但蟲草素未檢出。
　　3、采用響應面法對冬蟲夏草菌CC-10和蛹蟲草菌YC-1產(chǎn)多糖液體發(fā)酵培養(yǎng)基進行優(yōu)化，結(jié)果CC-10菌株最佳培養(yǎng)基配方為:葡萄糖9.32g/L、麥芽糖18.79g/L、蛋白胨6.14g/L、豆餅粉4g/L、MgSO40.5g/L、KH2PO41g/L、VB20.5mg/L，此時胞內(nèi)多

6、糖含量為4.16％，是優(yōu)化前的2.06倍。YC-1菌株最佳培養(yǎng)基配方為:蔗糖20.75g/L、蛋白胨8.17g/L、酵母浸粉5g/L、KH2PO41g/L、MgSO41.20g/L、ZnSO40.5g/L、VB10.1g/L，多糖含量為6.77％，是優(yōu)化前的2.34倍。
　　4、采用乙醇分級沉淀法對YC-1菌株和CC-10菌株的胞內(nèi)及胞外多糖進行提取，進一步純化后采用紅外光譜法對各多糖組分進行掃描，結(jié)果顯示10種組分均具有多糖特征

7、吸收峰，其中YC-1菌株ESP1在819cm-1處和CC-10菌株ISP1在811cm-1處的吸收峰表征其含有甘露糖。CC-10菌株ISP2在835cm-1和889cm-1處的吸收峰表征其含有α和β糖苷鍵，ESP1在835cm-1處的吸收峰表征含有α-糖苷鍵。采用PMP柱前衍生高效液相色譜法對單糖組成進行分析，結(jié)果為YC-1菌株和CC-10菌株的胞內(nèi)及胞外多糖主要含有甘露糖、葡萄糖、半乳糖、葡萄糖醛酸四種單糖，但每種多糖組分中單糖的種類