三氧化二砷對肺癌A549細(xì)胞周期的選擇性作用.pdf

1、[研究背景及目的] 據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)預(yù)測：至2025年,我國患肺癌人數(shù)將居世界之首,每年新增的肺癌病死例數(shù)將超過100萬。目前治療肺癌的主要方法是多學(xué)科綜合治療,主要包括手術(shù)、化療、放療及生物靶向治療等；這些治療均是通過不同途徑殺傷腫瘤細(xì)胞達(dá)到治療目的,但效果不盡如人意,在惡性腫瘤中的肺癌病死率是最高的,5年生存率在我國僅為10％左右。尋找有效的治療藥物和治療手段是擺在人們面前的一項迫不及待的任務(wù)。 三氧化二砷是

2、中藥砒霜的有效成份,過去中藥利用其“以毒攻毒”的原則來治療牙髓病以及銀屑病、梅毒、風(fēng)濕等疾病,因為有劇毒,臨床應(yīng)用范圍十分狹窄；然而自從20世紀(jì)七十年代三氧化二砷被用來治療急性早幼粒細(xì)胞性白血病并且獲得了較高的緩解率以來；三氧化二砷的抗腫瘤作用同益引起國人的重視。三氧化二砷不僅對急性早幼粒細(xì)胞性白血病有效果,對其它類型的白血病以及其他許多惡性腫瘤,如胃癌、前列腺癌、乳腺癌等都有一定的治療效果。 腫瘤的產(chǎn)生與細(xì)胞分化異常有關(guān)；三氧

3、化二砷可以誘導(dǎo)急性早幼粒細(xì)胞分化成為成熟粒細(xì)胞,通過阻滯細(xì)胞周期影響細(xì)胞生長與分化,達(dá)到抑制腫瘤的作用；誘導(dǎo)分化治療副作用小,療效不比常規(guī)化療差,因此誘導(dǎo)腫瘤分化正成為治療腫瘤的一種新的熱點。如果三氧化二砷對肺癌細(xì)胞也有一定的誘導(dǎo)分化作用,則有可能轉(zhuǎn)變肺癌的治療模式。目前國內(nèi)外有相關(guān)研究證實三氧化二砷對肺癌細(xì)胞有一定的細(xì)胞周期阻滯和誘導(dǎo)凋亡作用,但研究結(jié)果不盡相同,有報道三氧化二砷可以使肺癌細(xì)胞周期阻滯于G2/M期也有報道三氧化二砷可以

4、使肺癌細(xì)胞周期阻滯于G1期；細(xì)胞周期中G1期稱為細(xì)胞分化期,G1期停滯可作為細(xì)胞分化的指標(biāo),若能使細(xì)胞周期阻滯于G1期,則有可能誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞分化。 與其它細(xì)胞毒性藥物不同的是,三氧化二砷在部分低氧的實體腫瘤組織中作用仍較明顯；而且低氧可以加強三氧化二砷對白血病的誘導(dǎo)分化作用。低氧及厭氧環(huán)境對三氧化二砷肺癌細(xì)胞周期阻滯作用將產(chǎn)生怎樣的影響呢?是否更有利于肺癌細(xì)胞分化呢? 依托泊苷(VP-16)是白血病和肺癌治療中常用的藥物

5、,可以使腫瘤細(xì)胞周期阻滯于G2/M期,低濃度的VP-16能通過絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)途徑誘導(dǎo)慢性粒急性變的K562細(xì)胞分化。 本實驗首先在常氧環(huán)境下利用三氧化二砷對肺癌A549細(xì)胞體外誘導(dǎo)培養(yǎng),與細(xì)胞周期特異性藥物依托泊苷(VP-16)作對照,研究三氧化二砷在常氧環(huán)境下對肺癌A549細(xì)胞周期的作用特點；然后在微缺氧(5％)、厭氧環(huán)境觀察缺氧對其細(xì)胞周期阻滯作用的影響；從G1期阻滯角度來探討三氧化二砷對肺癌A549細(xì)胞可能

6、存在的誘導(dǎo)分化作用,為臨床上三氧化二砷治療肺癌提供理論依據(jù)。 [實驗方法] 一、實驗分組：根據(jù)處理藥物不同,將消化后的細(xì)胞隨機(jī)分成1μmol/L三氧化二砷與1.0μmol/L VP-16及空白對照組3個組,接種于24孔板；每組設(shè)6個復(fù)孔,每孔細(xì)胞接種密度約為3*105個/孔。 二、細(xì)胞培養(yǎng)：分別在常氧環(huán)境下體外誘導(dǎo)培養(yǎng)12小時、24小時、48小時；微缺氧、厭氧環(huán)境下體外誘導(dǎo)培養(yǎng)24小時,采用厭氧袋發(fā)生法制造微缺氧

7、及厭氧環(huán)境。 三、細(xì)胞收取：在各種氧環(huán)境下誘導(dǎo)培養(yǎng)至相應(yīng)時段以后,用含0.25％胰蛋白酶消化液消化各組細(xì)胞,收集、離心、棄上清后PBS洗滌、離心、棄上清兩次,加入70％冰乙醇固定,4℃過夜。 四、流式細(xì)胞儀(FCM)檢測細(xì)胞DNA含量：固定過夜后的細(xì)胞,加入PBS振蕩洗滌后離心棄上清,加入碘化丙啶(PI)染色,室溫避光孵育后進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測；每個流式細(xì)胞管檢測細(xì)胞數(shù)不低于8000個,低于G1期DNA含量主峰(亞G1期峰

8、)的細(xì)胞為凋亡細(xì)胞。 五、細(xì)胞周期分析：采用CellQuest軟件進(jìn)行細(xì)胞周期分析,結(jié)果以直方圖進(jìn)行表示；并計算出各期細(xì)胞比例。 六、統(tǒng)計學(xué)分析：細(xì)胞周期分析結(jié)果為百分比形式,以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析,具體分析方法詳見各部分。 [結(jié)果] (一)、常氧環(huán)境As2O3對肺癌A549細(xì)胞周期分布及細(xì)胞凋亡的作用1、隨作用時間的延長,1μmol/L As2O3組G1期細(xì)胞比例增加,

9、S期細(xì)胞比例減少,作用48小時,G1期細(xì)胞比例為47.04％,S期細(xì)胞比例為50.54％；與空白對照組相比較,G1期細(xì)胞比例明顯增加(P<0.05),S期細(xì)胞比例明顯減少(P<0.05);與VP-16組比較:G1期細(xì)胞比例無明顯差異,S期細(xì)胞比例較高(P<0.05),G2/M期細(xì)胞比例明顯減少(P<0.05)。 2、1μtmol/L As2O3組各時段細(xì)胞凋亡率與空白對照組相應(yīng)時段均無明顯差異,但各時段均較同等濃度VP-16組明

10、顯減少(P<0.05)。 (二)、不同氧環(huán)境As2O3對肺癌A549細(xì)胞周期分布及細(xì)胞凋亡的作用1、隨缺氧加重,1μmol/L As2O3組G1期細(xì)胞比例增加,S期細(xì)胞比例減少,與常氧、微缺氧環(huán)境相比,厭氧環(huán)境G1期、G2/M期細(xì)胞比例顯著增加(P<0.05)S期細(xì)胞比例顯著降低(P<0.05);與空白對照組比較,微缺氧環(huán)境G1期、S期細(xì)胞比例無明顯差異,厭氧環(huán)境G1期細(xì)胞比例明顯增加(P<0.05)、S期細(xì)胞比例明顯減少(P<

11、0.05);與VP-16組相比較：三種氧環(huán)境下各期細(xì)胞比例均有明顯差異,G1期、G2/M期細(xì)胞比例減少(P<0.05),S期細(xì)胞比例增加(P<0.05)。 2、與1μmol/L VP-16組相比較,As2O3組各種氧環(huán)境下細(xì)胞凋亡率均明顯減少(P<0.05);與空白對照組相比較,常氧及微缺氧環(huán)境無明顯差異,厭氧環(huán)境反而降低(P<0.05)。 [結(jié)論] 一、低濃度三氧化二砷對肺癌A549細(xì)胞G1期的阻滯作用具有一定的時-效