MiRNA與功能基因轉(zhuǎn)錄組聯(lián)合分析篩選延邊黃牛肉質(zhì)性狀候選基因.pdf

1、本研究以延邊黃牛為研究對(duì)象，運(yùn)用牛全基因組芯片和 miRNA芯片分別分析了閹牛和公牛背最長(zhǎng)肌組織的差異表達(dá)基因和差異表達(dá) miRNA，采用qRT-PCR技術(shù)對(duì)芯片結(jié)果進(jìn)行了驗(yàn)證。利用 miRanda程序?qū)Σ町惐磉_(dá) miRNA進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè)，并對(duì)差異表達(dá)基因和差異表達(dá) miRNA進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，構(gòu)建了 miRNA-基因作用網(wǎng)絡(luò)，對(duì)差異靶基因進(jìn)行 GO功能注釋和 Pathway分析，從而篩選出了影響肉質(zhì)性狀的功能基因和調(diào)控通路，并初步闡明 m

2、iRNA調(diào)控閹牛肉質(zhì)性狀形成的分子機(jī)制，為延邊黃牛肉質(zhì)性狀的遺傳機(jī)理和在肉牛生產(chǎn)中進(jìn)行分子育種提供了理論基礎(chǔ)。本研究主要結(jié)果如下：
　?。?）選取延邊黃牛公牛和閹牛各10頭進(jìn)行肉質(zhì)性狀測(cè)定，結(jié)果表明：閹牛肉含水量、粗脂肪含量和大理石花紋等級(jí)顯著高于公牛；閹牛的月桂酸、豆蔻酸、豆蔻油酸、棕櫚酸、棕櫚油酸、硬脂酸、油酸、亞油酸、亞麻酸、總脂肪酸、飽和脂肪酸、不飽和脂肪酸、單不飽和脂肪酸、多不飽和脂肪酸含量及背膘厚極顯著高于公牛。在脂肪

3、酸組成比例中，閹牛肉的硬脂酸、亞油酸、亞麻酸、多不飽和脂肪酸所占比例極顯著低于公牛，月桂酸、豆蔻酸、豆蔻油酸、棕櫚酸、棕櫚油酸、油酸和單不飽和脂肪酸所占比例極顯著高于公牛，飽和脂肪酸和不飽和脂肪酸所占比例閹牛與公牛差異不顯著。閹牛肉的粗蛋白含量和眼肌面積顯著低于公牛；閹牛肉的剪切力值極顯著低于公牛。
　?。?）隨機(jī)選取延邊黃牛公牛和閹牛各3頭，利用 Affymetrix牛全基因組芯片對(duì)其背最長(zhǎng)肌組織進(jìn)行差異表達(dá)分析。結(jié)果表明：在公

4、牛和閹牛之間共有85個(gè)基因存在差異表達(dá)，其中30個(gè)基因在閹牛中表達(dá)上調(diào)，55個(gè)基因在閹牛中表達(dá)下調(diào)。GO分析結(jié)果表明：32個(gè)基因涉及氧和活性氧代謝等生物學(xué)過(guò)程；22個(gè)基因與細(xì)胞頂端組成、II型主要組織相容性復(fù)合體蛋白復(fù)合物組成等細(xì)胞組成有關(guān)；39個(gè)基因與脂質(zhì)結(jié)合、維生素結(jié)合等分子功能有關(guān)。Pathway分析結(jié)果表明：27個(gè)差異基因參與57個(gè) KEGG通路。
　?。?）公牛和閹牛背最長(zhǎng)肌組織 miRNA芯片檢測(cè)結(jié)果表明：共有3737

5、個(gè)miRNA在公牛和閹牛背最長(zhǎng)肌中共同表達(dá)，其中246個(gè)為牛上已知的miRNA，另外3491個(gè)為未知 miRNA。對(duì)已知的miRNA差異表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)，有32個(gè) miRNA在公牛和閹牛中存在差異表達(dá)，其中25個(gè)在閹牛中上調(diào)表達(dá)、7個(gè)下調(diào)表達(dá)。根據(jù)miRNA與靶mRNA間的負(fù)調(diào)控關(guān)系，這與閹割后差異表達(dá)基因的表達(dá)趨勢(shì)一致，表明這些 miRNA可能與閹牛和公牛肉質(zhì)差異有關(guān)。并預(yù)測(cè)到了差異miRNA的7181個(gè)潛在靶基因。
　　（4）選擇

6、差異表達(dá)miRNA中的bta-miR-2407、bta-miR-122和bta-miR-15a三個(gè) miRNA和差異表達(dá)基因中的CRLF3、ABAT、USP15、SCN4B、ANGPTL4、ROCK2、DGAT2和 FABP4八個(gè)基因，對(duì)芯片結(jié)果進(jìn)行了 qRT-PCR驗(yàn)證，結(jié)果表明：所驗(yàn)證的miRNA和基因在公牛和閹牛間的差異倍數(shù)均達(dá)到顯著水平，其中FABP4、ANGPTL4和SCN4B三個(gè)基因達(dá)到極顯著水平，與 miRNA芯片和全基因

7、組芯片結(jié)果相符，表明芯片試驗(yàn)結(jié)果可靠。
　　（5）MiRNA芯片與全基因組芯片結(jié)果的關(guān)聯(lián)分析表明：延邊黃牛公牛和閹牛背最長(zhǎng)肌組織32個(gè)差異表達(dá)miRNA中有26個(gè)關(guān)聯(lián)到21個(gè)差異靶基因，其中20個(gè)miRNA表達(dá)上調(diào)、6個(gè)miRNA表達(dá)下調(diào)。20個(gè)表達(dá)上調(diào)的miRNA調(diào)控12個(gè)靶基因表達(dá)下調(diào)，6個(gè)表達(dá)下調(diào)的miRNA調(diào)控9個(gè)靶基因表達(dá)上調(diào)。
　　（6）對(duì)21個(gè)差異靶基因進(jìn)行GO和Pathway分析。GO分析結(jié)果顯示：閹牛中下調(diào)

8、的差異靶基因分屬于81個(gè)生物學(xué)過(guò)程、35個(gè)細(xì)胞組成、33個(gè)分子功能。閹牛中上調(diào)的差異靶基因分屬77個(gè)生物學(xué)過(guò)程、33個(gè)細(xì)胞組成、44個(gè)分子功能。Pathway分析結(jié)果顯示，下調(diào)差異靶基因?qū)?0個(gè) Pathway分類，上調(diào)差異靶基因?qū)?2個(gè) Pathway分類。
　　（7）通過(guò)關(guān)聯(lián)分析并結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道，初步認(rèn)為延邊黃牛公牛閹割后，bta-miR-2455、bta-miR-214、bta-miR-216b、bta-miR-671在閹牛背

9、最長(zhǎng)肌中表達(dá)下調(diào)，其調(diào)控基因 DGAT2、ANGPTL4、ROCK2、PLIN5表達(dá)量增加；bta-miR-122、bta-miR-1271、bta-miR-16a、bta-miR-200c、bta-miR-16b、bta-miR-29b、bta-miR-221、bta-miR-15a、bta-miR-199c、bta-miR-26b、bta-miR-31、bta-miR-224、bta-miR-27a-3p在閹牛背最長(zhǎng)肌中表達(dá)量上調(diào)，

10、抑制了其調(diào)控基因ABAT、ATP6V0D2、USP15、DDIT4、FPGT的表達(dá)。這些基因參與肌肉組織糖、脂肪、蛋白質(zhì)和能量代謝，主要涉及WNT信號(hào)通路，PPAR信號(hào)通路，甘油酯代謝，丁酸代謝，纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸降解，丙氨酸、天門冬氨酸和谷氨酸代謝，mTOR信號(hào)通路，β-丙氨酸代謝等，表明這些miRNA與延邊黃牛肉質(zhì)性狀密切相關(guān)。包括 DGAT2、ANGPTL4、ROCK2、PLIN5、ABAT、ATP6V0D2、USP15、D