雌激素撤退對(duì)轉(zhuǎn)染表達(dá)BRAF V600E的結(jié)腸上皮細(xì)胞生物學(xué)特征的影響.pdf

1、目的：
　　觀察雌激素水平改變對(duì)轉(zhuǎn)染表達(dá)BRAFV600E的結(jié)腸上皮細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期、侵襲和克隆形成能力的影響，以探討B(tài)RAFV600E突變的結(jié)腸上皮細(xì)胞在女性絕經(jīng)前后的生物學(xué)改變。
　　方法：
　　以過表達(dá)BRAFV600E質(zhì)粒和對(duì)應(yīng)空載體包裝成慢病毒感染正常結(jié)腸上皮細(xì)胞NCM460。嘌呤霉素篩選出陽性克隆(NCM-BRAFV600E、NCM-Vector)。再以正常NCM460細(xì)胞和感染了空載體質(zhì)粒的NCM460

2、細(xì)胞(NCM-Vector)作為對(duì)照，通過WB檢測感染了含BRAFV600E質(zhì)粒的NCM-BARFV600E細(xì)胞中BRAF/MEK通路激活情況，已建立NCM-BRAFV600E和NCM-Vector穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株。在有或無雌激素作用于NCM-BRAFV600E和結(jié)腸癌細(xì)胞RKO的條件下，利用流式細(xì)胞術(shù)AnnexinV/PI染色和WB檢測Caspase-3、BAX、BCL2蛋白以檢測NCM-BRAFV600E和RKO細(xì)胞的凋亡情況；采用W

3、B檢測NCM-BRAFV600E和RKO細(xì)胞中細(xì)胞周期相關(guān)蛋白P27、cyclinD2的表達(dá)情況；采用WB檢測NCM-BRAFV600E和RKO細(xì)胞中E-cadherin的表達(dá)情況;采用軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)，檢測NCM-BRAFV600E在瓊脂介質(zhì)中的克隆形成能力。
　　結(jié)果：
　　相對(duì)于無雌激素作用時(shí)，在有雌激素作用時(shí)，NCM-BRAFV600 E細(xì)胞中促凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3、BAX表達(dá)升高，而凋亡抑制蛋白BCL-

4、2表達(dá)降低，流式細(xì)胞術(shù)同樣顯示NCM-BRAFV600E凋亡比例增加；NCM-BRAFV600E細(xì)胞中細(xì)胞周期抑制蛋白P27表達(dá)升高，而細(xì)胞周期促進(jìn)蛋白cyclinD2表達(dá)降低；NCM-BRAFV600E細(xì)胞中E-cadherin表達(dá)增高；軟瓊脂介質(zhì)中NCM-BRAFV600E生長受到抑制；有或無雌激素作用于RKO，WB檢測凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3、BAX、BCL-2；細(xì)胞周期相關(guān)蛋白cyclinD2、P27；侵襲相關(guān)蛋白E-ca

5、dherin以及流式細(xì)胞術(shù)檢測凋亡均無明顯差異。
　　結(jié)論：
　　結(jié)腸上皮細(xì)胞（NCM460）發(fā)生BRAFV600E突變后雌激素仍對(duì)其有促進(jìn)細(xì)胞凋亡，抑制細(xì)胞周期、侵襲的作用，雌激素撤退后轉(zhuǎn)染表達(dá)BRAFV600E的結(jié)腸上皮細(xì)胞在軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)中克隆形成能力明顯增強(qiáng)，結(jié)果證實(shí)發(fā)生BRAF突變的結(jié)腸粘膜上皮的惡性轉(zhuǎn)化過程受雌激素的抑制，絕經(jīng)后其惡變過程可能加快。本研究提示絕經(jīng)后婦女BRAF突變腫瘤發(fā)病率明顯增加的原因與雌激