胃癌中E-cadherin表達(dá)的多樣性及其影響因素的探討.pdf

1、本實(shí)驗(yàn)首先分析了E-cadherinmRNA在胃癌組織和相對(duì)正常胃黏膜中的表達(dá)差異并與蛋白檢測(cè)的結(jié)果加以比較；而后，檢測(cè)了胃癌組織中E-cadherin轉(zhuǎn)錄抑制因子Snail、E-cadherin啟動(dòng)子的甲基化狀況，以期揭示E-cadherinmRNA與其蛋白下調(diào)之間的內(nèi)在聯(lián)系。 研究材料和方法：胃癌組織標(biāo)本選自大連醫(yī)科大學(xué)細(xì)胞生物學(xué)教研室(遼寧省高校癌癥基因組學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室)建立的人癌組織庫(kù)。胃癌細(xì)胞系A(chǔ)GS購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院上海分

2、院細(xì)胞庫(kù)；BGC823從北京腫瘤研究所引進(jìn)。采集的胃癌組織按Lauren分型分為腸型和彌漫型兩個(gè)亞型，并以癌旁相對(duì)正常胃粘膜和癌前病變(萎縮性胃炎和腸上皮化生)作為實(shí)驗(yàn)對(duì)照?；诒鶅龊褪灲M織微陣列(芯片)，結(jié)合組織特定區(qū)域的DNA、RNA及蛋白定點(diǎn)捕獲，應(yīng)用免疫組織化學(xué)、RT-PCR、甲基化特異性PCR(methylation-specificPCR，MSP)和Western蛋白印跡分析等方法，檢測(cè)E-cadherin和Snail在不

3、同類(lèi)型胃組織和胃癌細(xì)胞系中的表達(dá)以及E-cadherin甲基化的情況。然后，用Kruskal-Wallis和X2檢驗(yàn)等方法對(duì)上述指標(biāo)在不同胃組織中的表達(dá)進(jìn)行差異分析；用Spearman相關(guān)分析檢測(cè)這幾個(gè)指標(biāo)間的相關(guān)性。 研究結(jié)果： 1.胃癌組織中，分布在細(xì)胞膜上的膜型E-cadherin蛋白明顯減少，不同組織類(lèi)型的胃組織間存在明顯差異(P=0.000)，即隨著病變程度的加重，E-cadherin蛋白的含量呈遞減趨勢(shì)并在彌

4、漫型胃癌中尤為明顯。然而，與相對(duì)正常胃黏膜組比較胃癌組織中E-cadherin轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物(mRNA)的水平卻呈現(xiàn)出多樣性，表現(xiàn)為無(wú)變化和不同程度下降。 2.與相對(duì)正常黏膜(0/11)和癌前病變(0/14)相比較，胃癌組織的Snail表達(dá)頻率較高(9/30；P＜0.05)。不過(guò)，該基因的表達(dá)頻率在腸型(3/15)和彌漫型(6/15)胃癌之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。Snail表達(dá)與E-cadherin下調(diào)之間的相關(guān)性還有待于進(jìn)一

5、步分析。 3.甲基化特異性PCR(MSP)結(jié)果顯示，E-cadherin啟動(dòng)子區(qū)CpG島-1甲基化頻率在胃癌組織中占36.7﹪(11/30)，其中在E-cadherin轉(zhuǎn)錄下調(diào)病例中占40.7﹪(11/27)，而在胃癌患者的相對(duì)正常胃黏膜中占87.5﹪(7/8)，二者有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。E-cadherin啟動(dòng)子區(qū)CpG島-1甲基化與E-cadherin轉(zhuǎn)錄下調(diào)之間的相關(guān)性還有待于進(jìn)一步分析。 4.在檢測(cè)的30

6、例胃癌組織標(biāo)本中，有一例同時(shí)檢測(cè)到Snail和E-cadherin啟動(dòng)子區(qū)CpG島-1甲基化，但對(duì)應(yīng)的E-cadherinmRNA水平僅表現(xiàn)為輕微下降。有9例E-cadherinmRNA水平下降的胃癌組織均未檢測(cè)到Snail和E-cadherin啟動(dòng)子區(qū)CpG島-1甲基化。 5.胃癌中E-cadherinmRNA與其蛋白表達(dá)之間呈明顯正相關(guān)(r=0.671，P=0.000)，但是在約50﹪的胃癌病例中，E-cadherinmRN

7、A與其蛋白之間存在量性差異，即盡管有E-cadherinmRNA的存在，卻無(wú)相應(yīng)蛋白的產(chǎn)生。 6.兩個(gè)人胃癌細(xì)胞系(AGS和BGC823)的E-cadherin轉(zhuǎn)錄和翻譯水平較低并伴有細(xì)胞系A(chǔ)GSSnail的表達(dá)上調(diào)，但甲基化特異性PCR(MSP)結(jié)果顯示：胃癌細(xì)胞系A(chǔ)GS和BGC823中無(wú)E-cadherin啟動(dòng)子區(qū)CpG島-1甲基化。 研究結(jié)論：胃癌中E-cadherinmRNA水平存在多樣性，表現(xiàn)為無(wú)變化和不同程度

8、下降。兩種類(lèi)型的胃癌均可見(jiàn)到膜型E-cadherin的頻發(fā)下調(diào)表達(dá)甚至缺失并伴有Snail的表達(dá)上調(diào)和啟動(dòng)子區(qū)CpG島-1甲基化；兩個(gè)人胃癌細(xì)胞系表現(xiàn)為E-cadherin轉(zhuǎn)錄和翻譯水平較低并伴有細(xì)胞系A(chǔ)GSSnail的表達(dá)上調(diào)，但兩個(gè)細(xì)胞系均無(wú)E-cadherin啟動(dòng)子區(qū)CpG島-1甲基化。就相對(duì)正常胃黏膜組E-cadherin啟動(dòng)子區(qū)甲基化頻率高于胃癌組，文獻(xiàn)曾有報(bào)導(dǎo)，考慮為E-cadherin啟動(dòng)子區(qū)甲基化是年齡相關(guān)甲基化，非癌胃

9、黏膜發(fā)生甲基化很可能是胃黏膜上皮惡性轉(zhuǎn)化的早期報(bào)警信號(hào)；亦考慮到E-cadherin基因含有多個(gè)CpG島，而我們檢測(cè)的是其中之一，而它未必是引起E-cadherin沉默的關(guān)鍵靶點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)還首次披露，E-cadherinmRNA水平與蛋白水平存在不一致的情況，即盡管大約50﹪的胃癌病例的E-cadherin在mRNA水平有表達(dá)，但在蛋白水平卻難以檢出。這提示，在胃癌細(xì)胞內(nèi)很可能存在某種轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)(沉默)機(jī)制，如microRNA，一種通過(guò)與