腎細胞癌中AEG-1的表達及其與侵襲和轉(zhuǎn)移的關(guān)系研究.pdf

1、腎細胞癌(reanl cell carcinoma,RCC)是來源于腎小管上皮細胞的成人泌尿系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一，在泌尿系統(tǒng)的惡性腫瘤中發(fā)病率僅次于前列腺癌和膀胱的尿路上皮癌而位列第三，約占所有腫瘤的3％左右。近年來，腎細胞癌發(fā)病率有上升的趨勢。局限性腎細胞癌患者通過根治性手術(shù)可獲得根治。但由于腎細胞癌早期癥狀常不明顯，患者出現(xiàn)臨床癥狀時往往已經(jīng)進入局部進展期或晚期。大約一半左右的腎細胞癌患者在病程中會發(fā)生轉(zhuǎn)移，而轉(zhuǎn)移性的腎細胞癌對

2、傳統(tǒng)的化療和放療均不敏感，目前仍無有效的治療手段，預(yù)后極差。雖然目前對腎癌的免疫治療和靶向藥物治療已經(jīng)取得一定的進展，一定程度上改善了患者的預(yù)后，但這些治療抗腫瘤的持續(xù)效應(yīng)差，且副作用大，因此迫切需要進一步研究以明確腎細胞癌的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)分子機制，尋找有效的防治手段以進一步提高腎細胞癌治療效果。AEG-1(astrocyte elevated gene-1)是新近發(fā)現(xiàn)的一個基因，具有類似癌基因樣作用。已經(jīng)在人體腫瘤包括肺、乳腺、肝臟、

3、前列腺等一系列腫瘤細胞和腫瘤組織中發(fā)現(xiàn)表達顯著升高，并且其表達水平和腫瘤的進展存在相關(guān)性。體外研究發(fā)現(xiàn)調(diào)控AEG-1基因的表達可影響多種腫瘤細胞的生長、增殖、侵襲、凋亡等改變，體內(nèi)研究也發(fā)現(xiàn)AEG-1基因的上調(diào)與腫瘤的進展、轉(zhuǎn)移和侵襲之間有關(guān)。但有關(guān)AEG-1在腎細胞癌的發(fā)生、發(fā)展過程中的作用，目前尚無相關(guān)的研究。
　　 本研究首先應(yīng)用實時定量PCR、Westernblot、免疫組織化學(xué)、免疫熒光等方法檢測8例配對的散發(fā)性腎細胞

4、癌新鮮組織和癌旁組織的AEG-1mRNA和蛋白質(zhì)的表達情況，同時檢測了四種腎細胞癌細胞株的AEG-1mRNA和蛋白質(zhì)的表達，明確了AEG-1在腎細胞癌組織和細胞株中均存在顯著上調(diào)，隨后我們通過對102例患者AEG-1表達的半定量和臨床病理指標之間的關(guān)系進行統(tǒng)計學(xué)分析初步探討了AEG-1基因與腎細胞癌進展及與患者預(yù)后的關(guān)系；并進一步分析了AEG-1表達水平與E-cad及微血管密度的相關(guān)性，探討 AEG-1表達水平在腎細胞癌轉(zhuǎn)移中可能的作用

5、。最后，我們構(gòu)建pcDNA-AEG-1重組質(zhì)粒并設(shè)計了SiRNA片段分別上調(diào)和下調(diào)腎透明細胞癌細胞株786-0的AEG-1基因的表達，研究上調(diào)及下調(diào)AEG-1基因分別對細胞生長、細胞侵襲力、細胞凋亡、細胞周期等的影響，為AEG-1作為細胞腎癌治療新的靶點提供實驗依據(jù)。本研究分為三個部分：
　　 第一部分：AEG-1在腎細胞癌組織和細胞株中的表達。
　　 目的：檢測正常腎組織、腎細胞癌組織及腎細胞癌細胞株中AEG-1的mR

6、NA和蛋白質(zhì)的表達，探討AEG-1在腎細胞癌的發(fā)生中的作用。
　　 方法：運用real-time PCR和Western blot的方法檢測8例配對的腎細胞癌組織和癌旁正常腎組織及4種腎細胞癌細胞株與正常腎小管上皮細胞的AEG-1的mRNA和蛋白質(zhì)的表達水平。
　　 結(jié)果：⑴AEG-1在正常腎組織主要表達于腎小管，且主要位于遠端腎小管和集合管；表達的部位在正常腎小管細胞及腫瘤細胞均位于細胞漿，未見胞核表達。⑵Wester

7、n blot和real-time PCR顯示AEG-1的mRNA和蛋白水平在腎細胞癌組織的表達較同一患者癌旁組織顯著升高，升高幅度為2-38倍；石蠟組織的免疫組化顯示AEG-1蛋白表達的結(jié)果與Western blot和實時定量PCR的結(jié)果一致。⑶四種腎細胞癌細胞株中AEG-1的mRNA和蛋白水平較人正常腎小管上皮細胞HK-2顯著升高，升高幅度為2-12倍，其中轉(zhuǎn)移性腎細胞癌細胞株Caki-1的表達水平最高。細胞免疫熒光的結(jié)果與Weste

8、rn blot和實時定量PCR的結(jié)果一致。
　　 結(jié)論：我們的研究結(jié)果證實AEG-1蛋白在腎細胞癌細胞和組織均較其相應(yīng)的正常組織和細胞存在顯著上調(diào)，AEG-1可能在腎細胞癌的發(fā)生及發(fā)展過程中起一定作用。
　　 第二部分：AEG-1的表達水平與腎細胞癌進展及轉(zhuǎn)移的關(guān)系。
　　 目的：研究腎細胞癌組織中AEG-1的表達水平與腎細胞癌的病理學(xué)指標及臨床分期、患者的生存時間之間的關(guān)系。并通過分析AEG-1的表達水平與E-

9、cadherin及微血管密度MVD之間的關(guān)系，探討AEG-1在腎細胞癌轉(zhuǎn)移中的可能作用。
　　 方法：用免疫組化的方法半定量分析102例腎細胞癌患者的AEG-1蛋白表達，并分析AEG-1蛋白表達的水平與腎細胞癌的病理學(xué)指標及臨床分期、患者的生存時間之間的關(guān)系。同時檢測39例腎透明細胞癌組織中E-cadherin水平，免疫組化CD31標記內(nèi)皮細胞并計算微血管密度(mierovesseldensity，MVD)，分析AEG-1蛋白的

10、表達水平與E-cadherin和MVD之間的相關(guān)關(guān)系。
　　 結(jié)果：⑴102例腎細胞癌組織中96例患者(94.1％)可檢測到AEG-1蛋白的上調(diào)，透明細胞癌、乳頭狀腎細胞癌、嫌色細胞癌和集合管癌四種組織學(xué)類型的腎細胞癌均可見AEG-1蛋白表達的顯著上調(diào)。⑵86例透明細胞癌和10例乳頭狀癌患者AEG-1表達水平的統(tǒng)計學(xué)分析顯示AEG-1的表達水平與腎細胞癌的核級呈顯著正相關(guān)(P＜0.001)，并且與患者的臨床分期(P=0.003)

11、、腫瘤的大小(P=0.003)及轉(zhuǎn)移(P=0.032)相關(guān)，與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無顯著相關(guān)性(P=0.457)。⑶AEG-1高表達組患者的5年累積生存率僅為52.4％，顯著低于AEG-1低表達組的91.3％(P=0.002)，提示AEG-1表達高的患者預(yù)后差。⑷E-cadherin在腎細胞癌的表達水平顯著下調(diào)，約50％的腎細胞癌不表達E-cadherin，其表達水平與腎細胞癌的分級、臨床分期及轉(zhuǎn)移無顯著相關(guān)性，與其AEG-1的表達水平無相關(guān)性。

12、⑸MVD在不同核級腎細胞癌之間存在顯著性差異，隨著核級的增加，MVD隨之增加，并與AEG-1蛋白表達水平呈正相關(guān)(P=0.010，r=0.455)。
　　 結(jié)論：AEG-1蛋白在各種組織學(xué)類型的腎細胞癌均存在上調(diào)表達，且其表達水平與腫瘤的進展和轉(zhuǎn)移相關(guān)；AEG-1蛋白高表達提示預(yù)后較差；AEG-1蛋白與E-cadherin蛋白的表達水平無相關(guān)關(guān)系，而AEG-1的表達與MVD呈顯著正相關(guān)，提示AEG-1蛋白的高表達可能通過影響腫瘤

13、的微血管生成來促進腎細胞癌的轉(zhuǎn)移。
　　 第三部分：下調(diào)及上調(diào)AEG-1基因?qū)δI透明細胞癌細胞株786-0的影響。
　　 目的：研究下調(diào)及上調(diào)AEG-1基因?qū)ν该骷毎┘毎?86-0體外生長、侵襲能力和血管生成的影響，探討以AEG-1作為靶點治療腎細胞癌的可能性。
　　 方法：①設(shè)計和合成可抑制AEG-1表達的siRNA，并轉(zhuǎn)染進入786-0細胞中。利用real-timePCR和western blot方法檢測

14、AEG-1mRNA和蛋白表達情況，篩選出一條抑制效率最高的AEG-1-SiRNA。②利用pMD18-T載體克隆AEG-1開放讀碼框，經(jīng)測序鑒定后，構(gòu)建PCDNA/AEG-1重組質(zhì)粒并轉(zhuǎn)染入786-0細胞，G418篩選出高表達AEG-1的細胞。③成功上調(diào)和下調(diào)AEG-1基因的表達后，MTT法檢測細胞生長情況；Matrigel膠侵襲實驗檢測腎細胞癌細胞侵襲能力；流式細胞術(shù)檢測腎細胞癌細胞周期及細胞凋亡情況；明膠酶譜法測MMP-2、MMP-9

15、的活性；與HUVEC共培養(yǎng)觀察對內(nèi)皮細胞管狀結(jié)構(gòu)形成的影響。
　　 結(jié)果：⑴兩條siRNA片段均可顯著抑制AEG-1基因的表達，干擾的效果分別達到79％和75％，與空白對照組間有顯著性差異。⑵AEG-1 siRNA干擾786-0細胞后，與空白組和陰性對照組相比，MTT顯示AEG-1siRNA干擾組786-0細胞生長減慢(P＜0.05)；Matrigel侵襲實驗法顯示AEG-1siRNA干擾組細胞侵襲能力下降；流式細胞術(shù)分析表明與