缺氧微環(huán)境下AEG-1調控肝細胞癌多藥耐藥的實驗研究.pdf

1、肝細胞癌（Hepatocellular Carcinoma，HCC，以下簡稱肝癌）是世界上最常見的惡性腫瘤之一。多藥耐藥使肝癌患者的術后化療效果十分有限，這一直是遏制肝癌預后改善的關鍵問題。肝癌作為實體腫瘤，缺氧是肝癌細胞生存的真實微環(huán)境，而缺氧也是導致肝癌多藥耐藥的因素之一。因此，深入研究缺氧微環(huán)境下肝癌多藥耐藥的機制并積極探索有效的逆轉多藥耐藥的治療手段，對于進一步改善肝癌患者的治療效果及生存率具有極其重要的意義。
　　近年來

2、星形膠質細胞提升基因-1(astrocyte elevated gene-1，AEG-1)在腫瘤多藥耐藥中的作用逐漸引起人們的關注。AEG-1是新發(fā)現(xiàn)的癌基因，位于與多種惡性腫瘤的發(fā)生密切相關的人類8號染色體(8q22)上，研究表明其是促進腫瘤發(fā)生發(fā)展的一個關鍵因子。AEG-1是可以通過調控PI3K/Akt、NF-κB等多條信號途徑參與正常細胞轉化，腫瘤細胞增殖、侵襲、轉移，血管生成等腫瘤發(fā)生發(fā)展的多個環(huán)節(jié)，并能介導腫瘤細胞自噬活性和化

3、療耐藥。有研究認為，AEG-1可能是通過某些信號通路的調控來影響多藥耐藥基因-1(multidrug resistance gene1，MDR1)的表達，從而參與介導腫瘤多藥耐藥，但其具體作用機制目前尚不清楚。
　　本課題首先在肝癌組織、癌旁肝組織及正常肝組織標本中檢測AEG-1、MDR1的表達情況。然后研究在缺氧微環(huán)境下AEG-1的表達情況及其對MDR1表達、肝癌細胞系HepG2多藥耐藥性的影響;進而通過RNA干擾技術，在缺氧微

4、環(huán)境下特異性抑制肝癌細胞系HepG2中AEG-1的表達水平，并綜合利用一系列分子生物學和細胞生物學的方法研究AEG-1調控肝細胞癌多藥耐藥的可能分子機制。
　　第一章 AEG-1、MDR1在正常肝組織、癌旁肝組織及肝癌中的表達情況
　　目的：了解AEG-1在正常肝組織、癌旁肝組織及肝癌組織中表達情況及其與MDR1表達的相關性
　　方法：
　　(1)免疫組化檢測30例肝癌組織、30例癌旁肝組織及8例正常肝組織中AE

5、G-1、MDR1蛋白的表達情況。
　　(2)實時熒光定量PCR(qRT-PCR)方法檢測AEG-1、MDR1mRNA在30例新鮮肝癌組織及其配對的癌旁肝組織中的表達水平，8例新鮮正常肝組織作為對照。
　　結果：
　　(1)免疫組化法檢測結果顯示，肝癌組織中的AEG-1、MDR1蛋白陽性表達明顯高于癌旁肝組織和正常肝組織(P＜0.01)。而在癌旁肝組織和正常肝組織之間，兩者陽性表達情況無顯著性差異。
　　(2) q

6、RT-PCR檢測結果顯示，肝癌新鮮組織中AEG-1、MDR1mRNA表達水平均明顯高于癌旁肝組織和正常肝組織，差異均具有顯著性(P＜0.01)。而癌旁肝組織和正常肝組織之間，AEG-1、MDR1mRNA表達水平差異無統(tǒng)計學意義。
　　(3)根據(jù)免疫組化結果對AEG-1、MDR1兩者之間相關性研究得出r=0.725，P＜0.05;而根據(jù)qRT-PCR檢測結果進行相關性分析得出r=0.758，P＜0.01。
　　結論：
　

7、　AEG-1、MDR1基因在肝癌組織中高表達;而在癌旁肝組織和正常肝組織中均呈低表達。肝癌組織中AEG-1和MDR1的表達之間存在相關性，提示AEG-1對MDR1的表達存在調控關系。
　　第二章 缺氧微環(huán)境下AEG-1表達對HepG2多藥耐藥的影響
　　目的: 探討缺氧微環(huán)境下AEG-1的表達及其對HepG2多藥耐藥的影響
　　方法:
　　(1)常氧下HepG2作為對照組（A組）;以100μmol/L的COCl2

8、作用于肝癌細胞HepG2構建細胞缺氧模型作為實驗組（B組）;常氧下正常肝細胞L02作為正常對照組（C組）。
　　(2) qRT-PCR、Western blotting檢測各組細胞中AEG-1、MDR1mRNA和蛋白在0h、24h、48h表達量。
　　(3) MTT法檢測ADM、5-Fu、DDP在A、B兩組細胞中的48hIC50
　　結果:
　　(1) qRT-PCR方法檢測結果顯示，A組HepG2肝癌細胞株中的

9、 AEG-1、MDR1 mRNA表達量明顯高于C組L02細胞株(P＜0.01);B組HepG2肝癌細胞株中的AEG-1、MDR1 mRNA表達量明顯高于A組HepG2肝癌細胞株(P＜0.01)。
　　(2) Western blotting方法檢測結果顯示，A組HepG2肝癌細胞株中的AEG-1、MDR1蛋白表達量明顯高于C組L02細胞株(P＜0.01);B組HepG2肝癌細胞株中的AEG-1、MDR1蛋白表達量明顯高于A組Hep

10、G2肝癌細胞株(P＜0.01)。
　　(3) MTT法檢測結果顯示，B組ADM、5-Fu、DDP在HepG2中的48h IC50與A組比有明顯的升高，分別為A組的2.02倍(P＜0.01)，1.53倍（P＜0.01），1.90倍（P＜0.01）。
　　結論:
　　缺氧微環(huán)境下AEG-1、MDR1在肝癌HepG2細胞株中呈高表達，高表達的AEG-1可能通過上調MDR1的表達，參與介導了腫瘤的多藥耐藥。
　　第三章

11、AEG-1基因RNAi質粒載體的構建、鑒定與篩選
　　目的:構建AEG-1基因RNAi質粒載體，篩選出陽性干擾質粒及陰性干擾對照質粒
　　方法:
　　(1)設計靶序列并合成shRNA，構建干擾質粒載體 pGPU6-AEG-1-shRNA。其中pGPU6-AEG-1-shRNA-NC為陰性干擾質粒，pGPU6-AEG-1-shRNA-746、pGPU6-AEG-1-shRNA-1490、pGPU6-AEG-1-shRNA

12、-1576為陽性干擾質粒。
　　(2)酶切、測序鑒定質粒載體。
　　(3) Lip2000介導下轉染HepG2細胞，缺氧下培養(yǎng)48h。
　　(4)檢測轉染率。分為四組:A組AEG-1-shRNA-NC;B組AEG-1-shRNA-746; C組AEG-1-shRNA-1490; D組AEG-1-shRNA-1576。
　　(5) qRT-PCR、Western blotting檢測各質粒轉染肝癌HepG2細胞株中

13、AEG-1 mRNA和蛋白表達量。分為五組:A組HepG2+CoCl2;B組HepG2+CoCl2+shRNA-NC;C組HepG2+CoCl2+shRNA-746;D組HepG2+CoCl2+shRNA-1490;E組HepG2+CoCl2+shRNA-1576。
　　結果:
　　(1)經(jīng)酶切、測序鑒定，成功構建干擾質粒載體。
　　(2)檢測各質粒轉染肝癌HepG2細胞株轉染率，均達到75％左右，且各組間差異無統(tǒng)計學

14、意義。
　　(3) qRT-PCR、Western blotting方法檢測結果顯示，C組HepG2肝癌細胞株中的AEG-1 mRNA和蛋白表達量較其他各組中要低，差異具有顯著性(P＜0.01)，而B組細胞中AEG-1 mRNA和蛋白表達量與A組無明顯差別，差異無統(tǒng)計學意義。
　　結論:
　　1.成功構建pGPU6-AEG-1-shRNA質粒載體。
　　2.對靶基因AEG-1干擾效果較好的是pGPU6-AEG-1

15、-shRNA-746質粒載體;而pGPU6-AEG-1-shRNA-NC對HepG2細胞中AEG-1的表達幾無影響。
　　第四章缺氧微環(huán)境下RNAi抑制AEG-1表達對HepG2多藥耐藥的影響
　　目的:探討缺氧微環(huán)境下RNAi抑制AEG-1表達對HepG2多藥耐藥的影響
　　方法:
　　(2)有效干擾質粒pGPU6AEG-1RNAi+和無效對照組質粒pGPU6AEG1RNAi-轉染HepG2肝癌細胞。
　

16、　(2)分為空白對照組(A組:HepG2+CoCl2)、陰性干擾組(B組:HepG2AEG-1-RNAi-+COCl2)、陽性干擾組(C組:HepG2AEG-1-RNAi++COCl2)
　　(3) qRT-PCR、Western blotting檢測各組肝癌HepG2細胞株中AEG-1、MDR1 mRNA和蛋白0h、24h、48h表達量。
　　(4) MTT法檢測ADM、5-Fu、DDP在各組細胞中的48h IC50。

17、r>　　結果:
　　(1) qRT-PCR方法檢測結果顯示，C組HepG2肝癌細胞株中的AEG-1、MDR1 mRNA表達量明顯低于A、B組中的表達，差異有顯著性(P＜0.01);A、B兩組中的表達差異無統(tǒng)計學意義。
　　(2) Westem blotting檢測結果顯示，C組HepG2肝癌細胞株中的AEG-1、MDR1 mRNA表達量明顯低于A、B組中的表達，差異有顯著性（P＜0.01）;A、B兩組中的表達差異無統(tǒng)計學意義

18、。
　　(3) MTT法檢測結果顯示，缺氧微環(huán)境下ADM、5-Fu、DDP在C組HepG2中的48h IC50和A組比較有明顯的降低，分別為A組的0.59倍(P＜0.01)，0.69倍(P＜0.01)，0.66倍(P＜0.01)。A、B兩組比較無統(tǒng)計學意義。
　　結論:
　　(1)缺氧微環(huán)境下特異性抑制HepG2中AEG-1的表達，可顯著下調MDR1的表達，提示AEG-1作為MDR1的上游基因，可以上調MDR1的表達。