MHV-3誘導(dǎo)的小鼠SARS模型及其在SARS感染中的研究應(yīng)用.pdf

1、[目的] 1.克服現(xiàn)有嚴(yán)重急性呼吸綜合征(SARS)動(dòng)物模型的局限性，提供一種建立SARS冠狀病毒小鼠模型的方法，為系統(tǒng)研究SARS疾病的病原學(xué)與發(fā)病機(jī)制提供技術(shù)平臺(tái)。 2.結(jié)合小鼠SARS模型肺臟中鼠纖維介素基因(mfgl2凝血酶原酶基因)的特異性表達(dá)來探討SARS肺損傷的可能機(jī)制及其臨床意義。 3.結(jié)合小鼠SARS模型肝組織的病理學(xué)變化、病毒分布及肝功能損傷情況，探討SARS合并肝臟損傷的可能機(jī)制。

2、[材料與方法] 實(shí)驗(yàn)組Balb/cJ近交系小鼠通過呼吸道途徑感染100PFU鼠肝炎3型病毒(MHV-3)，平行設(shè)立生理鹽水對(duì)照組，觀察兩組小鼠的一般情況并繪制生存曲線。在獲得穩(wěn)定生存曲線的前提下，另外制備動(dòng)物模型，分不同時(shí)間點(diǎn)(1d、2d、3d、4d)收集血清標(biāo)本和組織臟器標(biāo)本，后者包括肺臟、脾臟、肝臟、腎臟、小腸、心臟和腦組織，觀察大體情況后根據(jù)檢測(cè)目的，部分組織速凍于液氮，部分組織固定于10％福爾馬林，常規(guī)制備石蠟切片。蘇木

3、素/伊紅(H&E)染色觀察各器官的組織病理學(xué)改變。標(biāo)準(zhǔn)噬斑法動(dòng)態(tài)觀察各組織器官病毒滴度的變化情況。針對(duì)MHV-3N基因區(qū)保守序列設(shè)計(jì)兩段寡核苷酸探針，原位雜交方法檢測(cè)病毒侵犯組織器官的細(xì)胞類型。運(yùn)用mfgl2多克隆抗體和特異性探針檢測(cè)mfgl2凝血酶原酶在肺臟中的表達(dá)情況。免疫組化雙染色觀察肺臟中mfgl2凝血酶原酶表達(dá)與纖維素沉積間的關(guān)系。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)三只小鼠血清標(biāo)本送檢本院檢驗(yàn)科測(cè)定谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、白蛋白(

4、ALB)、總膽紅素(TBiL)的水平。 [結(jié)果] 1.MHV-3呼吸道途徑誘導(dǎo)的小鼠SARS模型的建立 實(shí)驗(yàn)組小鼠通過氣管途徑感染100PFUMHV-3后5天內(nèi)死亡率高達(dá)100％，生理鹽水對(duì)照組小鼠全部存活且健康生長(zhǎng)。組織病理學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)病變可累及多個(gè)臟器。肺臟呈現(xiàn)典型間質(zhì)性肺炎樣改變伴廣泛透明膜、微小血栓形成；脾臟白髓萎縮，淋巴細(xì)胞稀疏，晚期脾小體偶見局灶性壞死，結(jié)構(gòu)不清；輕度到中度非特異性炎性改變亦見于肝臟、腎

5、臟等其他器官。所有收集的臟器均可檢測(cè)到病毒的分布，隨著感染時(shí)間的延長(zhǎng)，病毒在各組織臟器中的繁殖呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，采用單因素方差分析觀察感染后2d各組織臟器的病毒滴度差異，認(rèn)為該時(shí)間點(diǎn)病毒滴度的分布具有組織器官差異性，其中肺臟、脾臟、肝臟病毒滴度顯著高于腎臟、小腸、心臟和腦組織。原位雜交技術(shù)檢測(cè)到病毒侵犯的細(xì)胞類型包括：支氣管漿液腺上皮細(xì)胞、肺內(nèi)間質(zhì)浸潤(rùn)細(xì)胞、肺泡上皮細(xì)胞、脾臟生發(fā)中心周圍淋巴細(xì)胞、肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞、遠(yuǎn)曲腎小管上皮細(xì)胞、小腸黏膜上皮

6、細(xì)胞、心肌細(xì)胞和大腦神經(jīng)元。 2.mfgl2凝血酶原酶在小鼠SARS模型肺臟中的表達(dá) 運(yùn)用兔源性mfgl2多克隆抗體和特異性的探針可以在感染后肺組織支氣管漿液腺上皮細(xì)胞、間質(zhì)浸潤(rùn)細(xì)胞和肺泡上皮細(xì)胞中檢測(cè)到mfgl2蛋白和mfgl2mRNA的特異性高表達(dá)。免疫組化雙染色發(fā)現(xiàn)肺內(nèi)微小血栓及透明膜形成的區(qū)域多見mfgl2凝血酶原酶與纖維素的共沉積。 3.MHV-3誘導(dǎo)的小鼠SARS模型的肝損傷研究 組織病理學(xué)發(fā)

7、現(xiàn)肝臟小葉結(jié)構(gòu)基本完整，肝細(xì)胞彌漫混濁腫脹，大面積氣球樣變和水樣變，匯管區(qū)少量淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，偶見中央靜脈周圍肝細(xì)胞的點(diǎn)灶狀壞死。隨著感染時(shí)間的延長(zhǎng)，肝內(nèi)病毒復(fù)制加劇，病毒可直接侵犯肝臟實(shí)質(zhì)細(xì)胞，出現(xiàn)以ALT和AST升高為主的肝功能損傷。 [結(jié)論] 1.MHV-3呼吸道途徑誘導(dǎo)的小鼠SARS模型重復(fù)性好、臨床癥狀明顯，可以復(fù)制出與人類SARS相似的疾病特征，將為系統(tǒng)的研究SARS疾病的病原學(xué)、發(fā)病機(jī)制及疫苗研制、有效藥物的

8、篩選提供一種較為理想的技術(shù)平臺(tái)。 2.mfgl2凝血酶原酶在模型肺臟的特異性高表達(dá)可激活凝血酶原，啟動(dòng)局部凝血過程，導(dǎo)致纖維素沉積，促進(jìn)肺內(nèi)血栓和透明膜的形成，最終導(dǎo)致通氣血流障礙和血氧飽和度下降而造成肺臟功能的衰竭。提示除了病毒本身所致細(xì)胞病變，mfgl2凝血酶原酶可能成為SARS病程中肺功能損傷的又一重要分子機(jī)制。 3.與人類SARS肝損傷相似，MHV-3呼吸道途徑誘導(dǎo)的小鼠SARS模型其肝臟實(shí)質(zhì)性病變較輕，可能僅為