SARS的實(shí)驗(yàn)室診斷和基因芯片在SARS檢測(cè)中的應(yīng)用.pdf

1、傳染性非典型肺炎，又稱(chēng)嚴(yán)重急性呼吸綜合征(SevereAcuteRespiratorySyndrome，SARS)，是由SARS冠狀病毒感染引起的新發(fā)急性傳染病。2002年11月在我國(guó)廣東省首次發(fā)現(xiàn)后，至2003年6月，在短短時(shí)間里，蔓延肆虐于世界32個(gè)國(guó)家和地區(qū)，患者達(dá)八千多例，死亡七百多人，其中中國(guó)內(nèi)地5327例，死亡349例，廣東省21個(gè)地級(jí)市，有15市共報(bào)告1512病例，死亡58例。2004年初，廣東又發(fā)現(xiàn)4個(gè)新的散發(fā)病例，此外

2、，臺(tái)灣、新加坡、和我國(guó)還發(fā)生多起實(shí)驗(yàn)室感染事故，SARS己成為二十一世紀(jì)首個(gè)對(duì)人類(lèi)健康造成嚴(yán)重危害的新發(fā)傳染病。 由于SARS的臨床癥狀與其它呼吸道病毒性傳染病很難區(qū)分，實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)對(duì)其正確診斷極其重要。本研究采用包括病毒分離培養(yǎng)、血清學(xué)、分子生物學(xué)、基因芯片等多種SARS-CoV實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法，對(duì)SARS-CoV進(jìn)行多項(xiàng)研究，包括：對(duì)SARS爆發(fā)初期的病原體進(jìn)行分離鑒定；對(duì)SARS爆發(fā)期間報(bào)告病例進(jìn)行篩查；對(duì)SARS血清抗體流行

3、情況和SARS病原體的可能來(lái)源進(jìn)行研究；利用包括基因芯片在內(nèi)的各種最新檢測(cè)技術(shù)建立實(shí)驗(yàn)室診斷方法，為SARS病例的確診提供依據(jù)。經(jīng)研究，得到以下結(jié)果。 1.SARS病原體的分離鑒定及指示病例(各地首發(fā)病例和死亡病例)檢測(cè)結(jié)果采用VeroE6細(xì)胞對(duì)在廣東省首先發(fā)現(xiàn)的SARS病人的咽拭子標(biāo)本進(jìn)行分離培養(yǎng)，并使用電鏡、間接免疫熒光(IFA)、巢式PCR及核苷酸序列測(cè)定等方法對(duì)分離物進(jìn)行鑒定，應(yīng)用ELISA、熒光PCR等技術(shù)對(duì)指示病例(

4、各地首發(fā)病例和死亡病例)進(jìn)行檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在廣東省各地病人的咽拭子標(biāo)本中，均檢測(cè)出SARS冠狀病毒；河源市、佛山市、肇慶市、中山市、東莞市、珠海市首發(fā)病例SARS冠狀病毒IgG抗體檢測(cè)結(jié)果均為陽(yáng)性，全省9例臨床診斷為SARS死亡的病例的相關(guān)檢材檢測(cè)結(jié)果顯示4例PCR結(jié)果陽(yáng)性，4例血清學(xué)檢測(cè)結(jié)果陽(yáng)性，兩項(xiàng)指標(biāo)結(jié)合證明7例與SARS感染有關(guān)，只有2例未能證明與SARS病毒感染有關(guān)。由此可見(jiàn)，廣東省首先發(fā)現(xiàn)的傳染性非典型肺炎的病原體是S

5、ARS冠狀病毒；各市臨床診斷的SARS首發(fā)病例和死亡病例確實(shí)與SARS冠狀病毒感染有關(guān)。 2.廣東省各類(lèi)SARS報(bào)告病例標(biāo)本實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)與臨床診斷結(jié)果的符合程度應(yīng)用熒光定量PCR和巢式PCR技術(shù)檢測(cè)病人咽拭子中SARS病毒特異基因，應(yīng)用ELISA和間接免疫熒光法檢測(cè)SARS病人恢復(fù)期血清中的SARS病毒IgG抗體。通過(guò)比較不同發(fā)病時(shí)間、有無(wú)明確接觸史的SARS臨床確診病人和疑似病人實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)果與臨床診斷結(jié)果、流行病學(xué)資料之間的符

6、合程度，可以為臨床診斷提供更可靠的依據(jù)，達(dá)到更準(zhǔn)確地確認(rèn)或排除SARS病例的目的。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,2003年1、2、3、4、5月份，每月臨床確診病例PCR陽(yáng)性率分別為：100％(2/2)、76.19％(16/21)、73.17％(30/41)、24.56％(14/57)、11.11％(2/18)，IgG抗體陽(yáng)性率分別為100％(2/2)、78.57％(13/18)、58.33％(32/67)、30.30％(10/35)、9.52％(2/2

7、1)，陽(yáng)性率逐月下降，4至5月份陽(yáng)性率較低；1至4月份的臨床確診病例中，有明確接觸史的病例，PCR和IgG抗體陽(yáng)性率分別為73.58％(39/53)、74.42％(32/43)，無(wú)明確接觸史的病例，PCR和IgG抗體陽(yáng)性率分別為32.14％(27/84)、25.58％(22/86)，有無(wú)明確接觸史臨床確診病例陽(yáng)性率有顯著性差異；4至6月份，凝似病人PCR和IgG抗體了的陽(yáng)性率分別為11.89％(54/454)、7.78％(21/270)

8、，陽(yáng)性率很低。以上結(jié)果說(shuō)明,SARS爆發(fā)后期(4至5月)的臨床確診病例有部分并非由SARS病毒感染；無(wú)明確接觸史臨床確診病例比陽(yáng)性率有顯著性差異，說(shuō)明結(jié)合流行病學(xué)資料可以使臨床診斷更準(zhǔn)確；凝似病例陽(yáng)性率很低，說(shuō)明大部分可能并非SARS病毒感染。必須綜合臨床癥狀、流行病學(xué)資料和實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行分析，才能得到更準(zhǔn)確可靠的診斷結(jié)果，為客觀分析疫情發(fā)展趨勢(shì)提供科學(xué)依據(jù)。 3.廣東省不同人群SARS血清抗體流行情況及野生動(dòng)物與SARS傳

9、播的相關(guān)性 在廣州等16市分別采集健康人群不同年齡組、果子貍等野生動(dòng)物飼養(yǎng)經(jīng)營(yíng)人員血清，用ELISA法檢測(cè)其SARS-CoVIgG抗體。通過(guò)比較各類(lèi)人群SARS-CoV抗體陽(yáng)性率，探討野生動(dòng)物與SARS傳播的相關(guān)性及各類(lèi)人群對(duì)SARS冠狀病毒的易感性。本研究共檢測(cè)各類(lèi)人群血清10718份，陽(yáng)性203份，陽(yáng)性率為1.89％。其中，社區(qū)健康人群陽(yáng)性率為0.68％(53/7783)；野生動(dòng)物密切接觸人群陽(yáng)性率為6.38％(123/19

10、28)；兩者陽(yáng)性率有顯著性差異(x2=281,P＜0.01)；與SARS病人有密切接觸史的醫(yī)務(wù)人員陽(yáng)性率為2.68％(27/1007)；社區(qū)健康人群中，來(lái)自SARS流行地區(qū)和非流行地區(qū)的陽(yáng)性率分別為0.81％(44/5431)和0.38％(9/2352)，兩者有顯著性差異(x2=4.44，P＜0.05)；野生動(dòng)物密切接觸人群中，來(lái)自SARS流行地區(qū)和非流行地區(qū)的陽(yáng)性率分別為7.34％(116/1580)和2.01％(7/348)，兩者有

11、顯著性差異(x2=13.57，P＜0.01)；在與果子貍等野生動(dòng)物密切接觸人群中，果子貍場(chǎng)飼養(yǎng)人員、野生動(dòng)物市場(chǎng)銷(xiāo)售人員及有供應(yīng)野生動(dòng)物的酒樓工作人員陽(yáng)性率分別為3.25％(4/123)、10.59％(100/944)和2.21％(19/861)，明顯比其它健康人群高；在肇慶等3市的健康人員中，成年人、小學(xué)生、幼兒園小孩陽(yáng)性率分別為0.16％(7/3845)、1.04％(17/1632)和3.52％(19/540)，低年齡組的抗體陽(yáng)性率

12、明顯高于成年組。以上結(jié)果說(shuō)明，普通人群對(duì)SARS冠狀病毒普遍易感；野生動(dòng)物與SARS冠狀病毒傳播有一定聯(lián)系；除果子貍外，市場(chǎng)中可能還有其它動(dòng)物攜帶SARS冠狀病毒。 4.2003年12月至2004年1月廣東省新發(fā)SARS病例實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)果 通過(guò)連續(xù)、系統(tǒng)地采集2003年12月-2004年1月廣東省新發(fā)4例SARS懷疑病例不同發(fā)病時(shí)間的各類(lèi)標(biāo)本，采用酶聯(lián)免疫法、間接免疫熒光法、中和試驗(yàn)等血清學(xué)檢測(cè)技術(shù)和Real-timeP

13、CR分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)檢測(cè)采集的標(biāo)本，并對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行分析，為SARS病例的實(shí)驗(yàn)室診斷提供科學(xué)的依據(jù)。血清學(xué)檢測(cè)結(jié)果顯示，4例病例在發(fā)病后第6至8天，均可檢測(cè)到SARS-CoVIgM和IgG抗體；前3例病例SARS-CoV抗體有4倍或4倍以上增長(zhǎng)；第4例病例SARS-CoVIgG抗體雖無(wú)4倍增長(zhǎng)，但卻有明顯的抗體陽(yáng)轉(zhuǎn)過(guò)程。同時(shí)采用ELISA法、IFA法和中和試驗(yàn)進(jìn)行抗體檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果基本一致。用Real-timePCR檢測(cè)咽拭等標(biāo)本，從

14、病例1的3份咽拭標(biāo)本中檢測(cè)到SARS-CoV核酸，其它標(biāo)本SARS-CoV核酸檢測(cè)結(jié)果都為陰性。對(duì)陽(yáng)性的標(biāo)本，采用RT-PCR擴(kuò)增出SARS-CoV的M、N、S基因，S基因序列和種系發(fā)生分析提示，該病毒與從廣東省果子貍中分離到的SARS毒株最接近。檢測(cè)結(jié)果證明這4例報(bào)告病例可以確認(rèn)為SARS實(shí)驗(yàn)室確診病例，該研究為SARS的實(shí)驗(yàn)室診斷提供了完善的檢測(cè)方案，結(jié)果得到美國(guó)CDC等WHO參比實(shí)驗(yàn)室的確認(rèn)。 5.雙重限制性熒光標(biāo)記技術(shù)在

15、SARS-CoV基因芯片檢測(cè)中的應(yīng)用 分別采用傳統(tǒng)限制性熒光標(biāo)記技術(shù)(直接采用熒光標(biāo)記的通用引物標(biāo)記)和雙重限制性熒光標(biāo)記技術(shù)(熒光標(biāo)記的通用引物和熒光標(biāo)記的dNTP的雙重?zé)晒鈽?biāo)記,DoubleRestrictionFluorescentLabeling，DRFL)標(biāo)記SARS-CoV微量核酸樣品，并進(jìn)一步在同等條件下與基因芯片進(jìn)行雜交、清洗和進(jìn)行基因芯片的掃描檢測(cè)。通過(guò)對(duì)雜交結(jié)果的分析，比較兩種標(biāo)記方法的標(biāo)記效果，探索提高基因

16、芯片用于病原體檢測(cè)的靈敏度。結(jié)果顯示，以DRFL方法標(biāo)記SARS基因片段，其熒光強(qiáng)度均值提高了3.5835倍。因此，DRFL技術(shù)能有效地提高單位分子標(biāo)記片段的熒光強(qiáng)度值，并進(jìn)一步提高了檢測(cè)的靈敏度，可用于微量病原體核酸樣品的基因芯片檢測(cè)。 6.SARS-CoV基因芯片在SARS檢測(cè)中的應(yīng)用 采用SARS-CoV寡核苷酸基因芯片對(duì)200份臨床確診SARS病例的咽拭/咽漱液、401例非SARS感染的呼吸道病人的咽拭/咽漱液樣

17、品用雙盲法進(jìn)行檢測(cè)。首先提取可能存在的病毒RNA，利用限制性熒光標(biāo)記法標(biāo)記，在同等條件下，進(jìn)行基因芯片雜交、清洗和芯片掃描檢測(cè)。通過(guò)對(duì)雜交結(jié)果的數(shù)據(jù)分析，與臨床診斷和血清學(xué)的檢測(cè)結(jié)果比較，對(duì)該方法的靈敏度和特異性及應(yīng)用于SARS早期診斷的可能性進(jìn)行評(píng)價(jià)。對(duì)601份標(biāo)本檢測(cè)的結(jié)果，靈敏度為71.50％，特異度為92.01％。對(duì)發(fā)病十天內(nèi)采集臨床確診SARS病例的標(biāo)本，檢測(cè)的靈敏度為81.08％。結(jié)果表明，利用SARS-CoV寡核苷酸基因芯