NGF-VEGF基因治療局灶性腦缺血再灌注損傷的治療時(shí)間窗及MR影像學(xué)研究.pdf

1、第一部分：放射學(xué)引導(dǎo)下兔局灶性腦缺血再灌注模型的制作和質(zhì)控體系的建立 目的：通過(guò)摸索兔局灶性腦缺血模型的制作方法，探討量化實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型制作的質(zhì)量控制體系和評(píng)價(jià)體系，從而建立適合影像學(xué)評(píng)價(jià)的穩(wěn)定可控重復(fù)性好的兔局灶性腦缺血再灌注模型。 方法：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物按照不同的量化指標(biāo)分為六組，其中A組，不同品種的家兔；B組，不同的線栓；C組，不同栓塞時(shí)間(1h、2h、3h、4h)：D組，不同月齡(4-8月)、不同體重(2.0-5.0kg)

2、的家兔；E組，不同手術(shù)入路；F組，不同的再灌注時(shí)間。其中A組行頸內(nèi)動(dòng)脈血管造影；B-E組統(tǒng)計(jì)成功率、死亡率、進(jìn)行神經(jīng)功能缺損評(píng)分及磁共振成像和形態(tài)學(xué)觀察；F組于再灌注后不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行神經(jīng)功能缺損評(píng)分、磁共振成像及TTC染色觀察。 結(jié)果：選用健康、雄性，體重2.5-3.0kg、4.5-5 月的新西蘭白兔作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，直徑為0.53mm的導(dǎo)絲作為線栓材料，在X線透視引導(dǎo)下行大腦中動(dòng)脈阻塞，同時(shí)術(shù)前、術(shù)中、術(shù)后嚴(yán)格監(jiān)控血?dú)狻?/p>

3、血糖變化和其他影響因素，可有效地提高成功率、降低死亡率。綜合影像技術(shù)、神經(jīng)功能缺損評(píng)分及 TTC 染色是評(píng)價(jià)模型的理想體系。 結(jié)論：合理選擇實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、量化影響因素、建立完善的術(shù)前、術(shù)中和術(shù)后三級(jí)評(píng)價(jià)體系，是建立穩(wěn)定、可控的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷谋匾獥l件，也是進(jìn)一步開(kāi)展缺血再灌注的病理生理變化的研究和MR影像學(xué)研究的基礎(chǔ)。 第二部分：多參數(shù)MRI動(dòng)態(tài)評(píng)價(jià)兔局灶性腦缺血再灌注模型的時(shí)間和組織特征性 目的：利用多參數(shù)MRI研究兔局

4、灶性腦缺血再灌注模型，探討腦缺血再灌注不同時(shí)間點(diǎn)的動(dòng)態(tài)變化規(guī)律。 方法：建立兔局灶性腦缺血再灌注模型，78 只雄性新西蘭白兔，隨機(jī)分為三組，其中A組6只，為空白對(duì)照組；B組12只，為假手術(shù)對(duì)照組；C組60只，為缺血再灌注組。采用改良頸內(nèi)動(dòng)脈線栓造模方法，將導(dǎo)絲置入頸內(nèi)動(dòng)脈，阻閉左側(cè)大腦中動(dòng)脈2h后抽出導(dǎo)絲恢復(fù)再灌注，于再灌注后1h、3h、6h、1d、3d、7d(均n=10)對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行行為評(píng)分、MRI、大體觀察、光鏡和電鏡檢查

5、。 結(jié)果：空白對(duì)照組、假手術(shù)組在各序列MRI上未見(jiàn)異常信號(hào)，模型組在缺血再灌注后不同時(shí)間均可在MRI表現(xiàn)出不同程度的腦組織損害征象。從再灌注Oh到7d所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物組織學(xué)檢測(cè)均與不同參數(shù)(T2-，T1-，diffusion- and perfusion-weighted imaging)得到的數(shù)據(jù)相一致。 結(jié)論：應(yīng)用多參數(shù)MR影像學(xué)對(duì)局灶性腦缺血再灌注模型進(jìn)行動(dòng)態(tài)評(píng)價(jià)，從而明確缺血再灌注時(shí)間和組織特征性，為進(jìn)一步研究腦缺血

6、的診斷和治療奠定基礎(chǔ)。 第三部分：NGF/VEGF基因治療局灶性腦缺血再灌注損傷的治療時(shí)間窗及MR影像學(xué)評(píng)價(jià) 實(shí)驗(yàn)一：NGF對(duì)兔局灶性腦缺血再灌注損傷的治療時(shí)間窗及MR影像學(xué)評(píng)價(jià) 目的：研究神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)對(duì)腦缺血再灌注損傷保護(hù)作用的有效時(shí)間窗，同時(shí)利用先進(jìn)的MR成像技術(shù)進(jìn)行評(píng)價(jià)。 方法：采用兔大腦中動(dòng)脈阻斷(MCAO)局灶性腦缺血再灌注模型，分別在缺血2h再灌注損傷后0h、1h、3h和6h應(yīng)用微量

7、進(jìn)樣器將NGF立體定向?qū)牍Ｋ涝钪?，于再灌?2h，應(yīng)用MR影像學(xué)、分子生物學(xué)、流式細(xì)胞學(xué)觀察梗死體積、水腫體積、神經(jīng)功能缺損、灶周凋亡率、表觀彌散系數(shù)比值(ADCR)和caspase-3蛋白表達(dá)。 結(jié)果：缺血再灌注0h、1h、3h灶周給予NGF，梗死體積分別比對(duì)照組下降50.1％、48.4％、37.6％，相應(yīng)的灶周凋亡率及caspase-3 含量明顯下降，灶周ADCR升高；再灌注6h后給藥，則無(wú)明顯作用。相關(guān)分析顯示梗死體積及

8、ADCR的變化與caspase-3蛋白表達(dá)下降程度明顯相關(guān)。 結(jié)論：NGF對(duì)兔局灶性腦缺血再灌注損傷的有效時(shí)間窗在再灌注損傷3h內(nèi)，灶周缺血半暗帶caspase-3 蛋白表達(dá)與治療時(shí)間窗有關(guān)，NGF可通過(guò)減少caspase-3 蛋白的表達(dá)減少腦缺血再灌注損傷細(xì)胞凋亡的發(fā)生。 實(shí)驗(yàn)二：VEGF治療局灶性腦缺血再灌注損傷的量效關(guān)系和神經(jīng)保護(hù)治療時(shí)間窗 目的：探討血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(VEGF)對(duì)家兔局灶性腦缺血再灌注

9、損傷的量．效治療關(guān)系和有效神經(jīng)保護(hù)治療時(shí)間窗。 方法：采用兔大腦中動(dòng)脈阻斷(MCAO)局灶性腦缺血再灌注模型，在缺血2h再灌注損傷后即刻應(yīng)用微量進(jìn)樣器將不同劑量的VEGF165(1-25ng/μL，2.5ng/μL，5.0ng/μL)立體定向?qū)牍Ｋ涝钪?，并選擇最適劑量，將給藥時(shí)間延遲至1h，3h，6h，12h，于再灌注72h，觀察梗死體積、灶周缺血半暗帶caspase-3蛋白表達(dá)、凋亡率、ADC值比率(ADCR)，評(píng)價(jià)神經(jīng)功能

10、缺損。 結(jié)論：2.5ng/μL INEGF 應(yīng)用治療家兔局灶性腦缺血再灌注損傷可誘導(dǎo)血管發(fā)生和神經(jīng)保護(hù)作用，是進(jìn)一步研究和評(píng)價(jià) VEGF 治療效應(yīng)的最佳劑量。VEGF 對(duì)兔局灶性腦缺血再灌注損傷的有效治療時(shí)間窗在再灌注損傷1h內(nèi)。 實(shí)驗(yàn)三：NGF 和VEGF 聯(lián)合應(yīng)用拓寬局灶性腦缺血再灌注損傷神經(jīng)保護(hù)治療時(shí)間窗 目的：觀察神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)對(duì)兔局灶性腦缺血再灌注損傷的神經(jīng)保護(hù)作用

11、，并探討其發(fā)生機(jī)制。 方法：34只雄性4.5-5 月齡新西蘭白兔隨機(jī)數(shù)字表法分為假手術(shù)組(n=6)、生理鹽水組(n=8)，再灌注3h因子治療組(n=10)和再灌注6h因子治療組(n=10)。采用兔大腦中動(dòng)脈阻斷局灶性腦缺血再灌注模型，假手術(shù)組線栓插入的深度不同。因子治療組在缺血2h再灌注損傷后3 h和6 h應(yīng)用微量進(jìn)樣器將2.5ng/μL VEGF165和NGF400AU(相當(dāng)于16μg/L)50μL 立體定向?qū)牍Ｋ涝钪?，生?/p>

12、鹽水組則注入同等劑量的生理鹽水，于再灌注72h，應(yīng)用MR影像學(xué)、TTC染色和流式細(xì)胞術(shù)評(píng)價(jià)各組動(dòng)物腦梗死體積、灶周缺血半暗帶細(xì)胞凋亡率、ADCR及caspase-3 活性表達(dá)。在大腦中動(dòng)脈阻塞2 h再灌注后24 h、72 h采用Purdy評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)行神經(jīng)功能缺損評(píng)分。 第四部分：細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶在NGF/VEGF 介導(dǎo)的神經(jīng)保護(hù)作用中的動(dòng)態(tài)變化及其調(diào)控機(jī)制 目的：探討細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(estracellular sig

13、nal-regulated kinase，ERK)在局灶性腦缺血/再灌注不同時(shí)間、不同腦區(qū)的動(dòng)態(tài)時(shí)空變化，以及其在NGF/VEGF介導(dǎo)的神經(jīng)保護(hù)作用中的調(diào)控表達(dá)機(jī)制。 方法：采用兔大腦中動(dòng)脈阻斷(MCAO)局灶性腦缺血再灌注模型，應(yīng)用免疫組化檢測(cè)ERK1在腦缺血2h再灌注不同時(shí)間海馬和皮層的動(dòng)態(tài)表達(dá)規(guī)律，同時(shí)，應(yīng)用免疫組化和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)caspase-3 和凋亡狀態(tài)的動(dòng)態(tài)變化，以及其在NGF/VEGF介導(dǎo)的神經(jīng)保護(hù)作用中的表達(dá)

14、。 結(jié)論：ERK 信號(hào)通路通過(guò)控制海馬和灶周皮層死亡受體途徑介導(dǎo)神經(jīng)保護(hù)作用，抑制ERK 信號(hào)途徑可能是預(yù)防缺血損傷過(guò)程中神經(jīng)細(xì)胞死亡的有效方法。 第五部分：急性腦心綜合征動(dòng)物模型的建立及意義的初步探討 在前期實(shí)驗(yàn)中，我們?cè)赬線透視引導(dǎo)下，應(yīng)用導(dǎo)絲阻斷大腦中動(dòng)脈，從而建立了穩(wěn)定可控重復(fù)性好的局灶性腦缺血再灌注模型。同時(shí)我們?cè)趯?shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)體重3.5-4.0kg、月齡5-6 月的家兔在造模時(shí)，于再灌注4-6h和24-3