膽堿干預(yù)對(duì)低氧暴露小鼠學(xué)習(xí)記憶的改善及其tau蛋白機(jī)制研究.pdf

1、研究目的:
　　高原地區(qū)屬于我國戰(zhàn)略要地，其低壓、低氧、寒冷等環(huán)境因素對(duì)人體多個(gè)系統(tǒng)產(chǎn)生影響，其中中樞神經(jīng)系統(tǒng)是對(duì)缺氧敏感的重要系統(tǒng)。低氧環(huán)境能夠?qū)ι窠?jīng)系統(tǒng)造成影響已經(jīng)得到證實(shí)，高原低氧對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)、認(rèn)知功能的影響機(jī)制作為熱點(diǎn)問題受到廣泛關(guān)注。神經(jīng)系統(tǒng)的多種病變都與神經(jīng)細(xì)胞中的tau蛋白有關(guān)，它是一種微管結(jié)合蛋白，當(dāng)其發(fā)生過度磷酸化時(shí)會(huì)影響微管正常生理功能，可能導(dǎo)致認(rèn)知功能減退。低氧暴露將對(duì)認(rèn)知功能造成怎樣的損傷？具體機(jī)制是什么？損

2、傷后能否通過有效手段進(jìn)行改善，例如營養(yǎng)補(bǔ)充。這一系列問題若能得到解決，將會(huì)對(duì)高原環(huán)境所致認(rèn)知功能障礙的預(yù)防與治療有重要意義，并可為特殊環(huán)境作業(yè)人員提供健康指導(dǎo)。
　　研究方法:
　　本研究以昆明小鼠為研究對(duì)象，建立慢性低氧暴露模型。通過曠場實(shí)驗(yàn)、避暗實(shí)驗(yàn)和八臂迷宮從整體水平來評(píng)價(jià)低氧暴露對(duì)學(xué)習(xí)記憶的影響。應(yīng)用蛋白免疫印跡從分子水平檢測其腦中tau蛋白磷酸化的水平，檢測乙酰膽堿相關(guān)酶類的活性，觀察膽堿能水平的變化。應(yīng)用HE染色

3、觀察神經(jīng)元的形態(tài)變化，判斷低氧暴露對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)的損傷程度。在明確慢性低氧暴露對(duì)小鼠認(rèn)知功能造成損傷后進(jìn)一步用膽堿及其它復(fù)合B族維生素進(jìn)行營養(yǎng)干預(yù)。從整體水平和分子水平兩個(gè)層面評(píng)價(jià)干預(yù)效果。因此，研究主要分為兩部分:1、不同低氧暴露時(shí)間對(duì)小鼠認(rèn)知功能的影響2、補(bǔ)充膽堿及其它復(fù)合B族維生素對(duì)低氧暴露小鼠認(rèn)知功能的改善。
　　結(jié)果:
　　一、低氧暴露對(duì)小鼠學(xué)習(xí)記憶能力及tau蛋白磷酸化的影響
　　將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為4組:對(duì)照組

4、(control group，control)、8h低氧暴露組(8h)、7d低氧暴露組(7d)、28d低氧暴露組(28d)。將模型組動(dòng)物放入低壓艙內(nèi)，環(huán)境條件為模擬海拔5500m高度。對(duì)照組放于常氧環(huán)境中，溫濕度與低氧組基本一致。曠場實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示8h低氧暴露后小鼠穿格數(shù)和直立次數(shù)呈降低趨勢，7d后略有升高，但均不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。28d低氧暴露后在中央?yún)^(qū)域的停留時(shí)間顯著延長(P＜0.05)，穿格數(shù)和直立次數(shù)顯著降低。避暗實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，急性

5、低氧8h后，小鼠避暗潛伏期有下降趨勢，連續(xù)低氧28d后顯著降低(P＜0.05)，錯(cuò)誤次數(shù)隨著低氧時(shí)間的增加而增多。說明急性低氧對(duì)小鼠的短期學(xué)習(xí)記憶能力有損傷，慢性低氧較急性低氧嚴(yán)重。
　　蛋白免疫印跡的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示在海馬組織中，隨著低氧時(shí)間的增加tau蛋白Thr181、Ser202/T205和Ser396位點(diǎn)的磷酸化程度有上升趨勢，在28d低氧暴露后顯著升高;低氧暴露8h、7d時(shí)，Ser262磷酸化程度未發(fā)生明顯改變，而28d后其

6、磷酸化程度明顯升高。皮層中的磷酸化Thr181、Ser262和Ser396含量在低氧暴露7d后達(dá)到最高，28d后略有下降;Ser202/T205位點(diǎn)的磷酸化水平隨著時(shí)間增加而升高，在28d時(shí)達(dá)到了最高。GSK-3β是重要的tau蛋白磷酸激酶之一，正常狀態(tài)下的GSK-3β誘導(dǎo)tau蛋白磷酸化，而過度磷酸化的GSK-3β則會(huì)喪失功能，被稱為抑制型GSK-3β。Western blot檢測結(jié)果顯示低氧28天后抑制型GSK-3β表達(dá)下調(diào)，說明低

7、氧暴露導(dǎo)致的tau蛋白過度磷酸化與抑制型GSK-3β減少有關(guān)。
　　神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿相關(guān)酶類變化的檢測結(jié)果顯示，與常氧環(huán)境對(duì)照組比較，低氧暴露28天時(shí)乙酰膽堿酯酶活性有升高趨勢，膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶活性顯著降低。由此可知低氧暴露28天對(duì)小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力影響最為嚴(yán)重。
　　HE結(jié)果顯示正常對(duì)照組海馬CA1區(qū)細(xì)胞呈橢圓形，染色均一，胞漿清晰，核仁明顯，細(xì)胞排列緊密有序、層次分明。與正常對(duì)照組相比，低氧暴露組海馬CA1區(qū)細(xì)胞排列相對(duì)疏

8、松，層次比較清晰。過度的磷酸化可使tau蛋白失去生物學(xué)功能，減弱tan蛋白促進(jìn)和穩(wěn)定微管聚合的能力，易于聚集成雙股螺旋細(xì)絲結(jié)構(gòu)，并可與神經(jīng)元中正常的微管相關(guān)蛋白結(jié)合，使微管結(jié)構(gòu)崩解，成為毒性分子，進(jìn)而導(dǎo)致神經(jīng)元退變。
　　二、補(bǔ)充膽堿及其它復(fù)合維生素B對(duì)低氧暴露小鼠認(rèn)知功能的影響
　　將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分成5組:對(duì)照組(CONTROL)、低氧暴露模型組(HYPOXIA)、低氧暴露同時(shí)補(bǔ)充其它復(fù)合維生素B組(HB)、低氧暴露同時(shí)補(bǔ)充膽

9、堿組(HC)、低氧暴露同時(shí)補(bǔ)充膽堿及其它復(fù)合維生素B組(HBC)。干預(yù)結(jié)束后首先從整體水平檢測其行為能力和記憶能力，通過行為學(xué)實(shí)驗(yàn)檢測。曠場實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與模型組相比，聯(lián)合補(bǔ)充膽堿及復(fù)合維生素B族組的潛伏期及穿格次數(shù)均有明顯升高趨勢，說明聯(lián)合補(bǔ)充膽堿和復(fù)合維生素B能減輕低氧對(duì)其活動(dòng)能力的影響，可以提高神經(jīng)系統(tǒng)興奮性。避暗實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示與模型組相比，單純補(bǔ)充維生素B族后小鼠的短期記憶能力沒有顯著性變化，單純補(bǔ)充膽堿后錯(cuò)誤率有下降趨勢，聯(lián)合補(bǔ)

10、充VB和膽堿后潛伏時(shí)間顯著升高，錯(cuò)誤次數(shù)下降。說明聯(lián)合補(bǔ)充膽堿及其它復(fù)合維生素B能夠改善慢性低氧暴露引起的短期記憶損傷。八臂迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與模型組相比，單純補(bǔ)充維生素B族后小鼠的典型錯(cuò)誤次數(shù)和錯(cuò)誤時(shí)間均未見明顯差異，聯(lián)合補(bǔ)充膽堿及其它維生素B后典型錯(cuò)誤次數(shù)和實(shí)驗(yàn)時(shí)間都有降低趨勢(P＜0.05）。提示補(bǔ)充膽堿對(duì)低氧暴露小鼠的空間記憶能力有明顯改善。
　　神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿相關(guān)酶類變化的檢測結(jié)果顯示，與低氧暴露模型組相比，補(bǔ)充膽堿后

11、乙酰膽堿酯酶活性有下降趨勢。由此可知，膽堿干預(yù)能夠改善中樞膽堿能系統(tǒng)。Western blot檢測結(jié)果顯示，與低氧暴露模型組相比，在海馬組織中，單純補(bǔ)充膽堿后T181位點(diǎn)的磷酸化水平顯著升高，聯(lián)合補(bǔ)充維生素B和膽堿后T181、S262、AT8位點(diǎn)的Tau蛋白磷酸化水平有所升高;在皮層組織中，補(bǔ)充膽堿后T181、S262、AT180、AT8和S396的磷酸化水平均有下降趨勢。說明補(bǔ)充膽堿及B組維生素能夠從分子水平降低Tau蛋白的磷酸化程度

12、。在皮層和海馬中抑制型GSK-3β的含量在聯(lián)合補(bǔ)充膽堿及維生素B后顯著增加。
　　結(jié)論:
　　慢性低氧暴露28天對(duì)小鼠的學(xué)習(xí)記憶造成損傷，主要機(jī)制是低氧因素導(dǎo)致磷酸化tau蛋白含量增加，膽堿能水平乙酰膽堿合成減少，進(jìn)而影響神經(jīng)系統(tǒng)功能。通過聯(lián)合補(bǔ)充膽堿及復(fù)合B族維生素能夠減輕這種損傷作用，Tau蛋白磷酸化水平下降，學(xué)習(xí)記憶得到改善。其可能機(jī)制是膽堿作為神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿的前體，口服后能夠通過血腦屏障，經(jīng)過與乙酰輔酶A的合成催化