轉(zhuǎn)蜘蛛Spidroin1基因綿羊早期克隆胚的研究.pdf

1、蜘蛛絲無與倫比的生物學(xué)特性決定了其在應(yīng)用領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。以生物學(xué)方法獲取具有蜘蛛絲特性的活性蛋白，亦或是通過轉(zhuǎn)基因的方法直接獲得類似蜘蛛絲的動物纖維，一直以來是許多科學(xué)研究者的奮斗目標(biāo)。本研究利用蜘蛛拖絲蛋白基因四聚體4S、pcDNA3.1和pIRES2-EGFP載體，在構(gòu)建pcDNA3.1-4S和pIRES2-EGFP-4S表達(dá)載體的基礎(chǔ)上，以脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將蜘蛛拖絲蛋白(Spidroin1)基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞并獲得轉(zhuǎn)基因陽性細(xì)胞株;

2、以轉(zhuǎn)基因陽性細(xì)胞為核供體，采用體細(xì)胞核移植的方法獲得轉(zhuǎn)蜘蛛Spidroin1基因綿羊克隆胚;采用PCR方法檢測轉(zhuǎn)基因克隆胚的蜘蛛拖絲蛋白(Spidroin1)基因整合狀況。本研究的結(jié)果如下:
　　1.pcDNA3.1-4S及pIRES2-EGFP-4S表達(dá)載體的構(gòu)建利用pcDNA3.1載體和蜘蛛拖絲蛋白基因四聚體4S構(gòu)建了pcDNA3.1-4S表達(dá)載體，BglⅡ、BamHⅠ雙酶切及PCR鑒定顯示，蜘蛛拖絲蛋白基因4S已連接到pcD

3、NA3.1-4S中;利用pIRES2-EGFP載體和蜘蛛拖絲蛋白基因4S構(gòu)建了pIRES2-EGFP-4S，XhoⅠ、BglⅡ雙酶切及PCR鑒定顯示，蜘蛛拖絲蛋白基因4S連接到pIRES2-EGFP中。
　　2.轉(zhuǎn)蜘蛛Spidroin1基因綿羊成纖維細(xì)胞系的建立將0.4μg/mL經(jīng)線性化的pcDNA3.1-4S和pIRES2-EGFP-4S，通過脂質(zhì)體法分別轉(zhuǎn)染利用常規(guī)方法經(jīng)原代和傳代培養(yǎng)的綿羊成纖維細(xì)胞，用含有抗生素和含400μ

4、g/mLG418的培養(yǎng)基進(jìn)行篩選，獲得轉(zhuǎn)pcDNA3.1-4S和pIRES2-EGFP-4S的陽性細(xì)胞;對獲得的轉(zhuǎn)基因陽性細(xì)胞進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察、生長曲線、倍增時間等生物學(xué)特性檢測結(jié)果，符合正常成纖維細(xì)胞的特性。
　　3.綿羊卵母細(xì)胞獲取方法的篩選通過比較抽吸、切割、抽吸結(jié)合切割的方法對綿羊的獲卵效果，其結(jié)果，與抽吸和切割法相比，劃線法輔助的切割法，能夠獲得最多的A、B級卵母細(xì)胞（約8個/每個卵巢）。
　　4.綿羊卵母細(xì)胞體外成

5、熟將A、B級卵母細(xì)胞以TCM199-HCO3+2.2g/mLNaHCO3+5μg/mL FSH+1IU/mL LH+1μg/mL雌二醇+50μg/mL慶大霉素+10％FBS+0.38mmol/L丙酮酸鈉+10mmol/L Hepes為培養(yǎng)液，對綿羊卵母細(xì)胞進(jìn)行體外成熟培養(yǎng)，可以獲得83.4％的最高成熟率。表明該成熟液適合用于綿羊卵母細(xì)胞的體外成熟。
　　5.成熟卵母細(xì)胞孤雌激活體外成熟綿羊卵母細(xì)胞用5μmol IA23187激活5

6、min后，再用2 mmol/L的6-DMAP培養(yǎng)4h，能夠獲得最高91.5％的激活率，激活后的孤雌胚經(jīng)培養(yǎng)后84.7％胚胎發(fā)育至桑椹胚。本研究結(jié)果顯示，IA23187聯(lián)合6-DMAP的激活方法可用于綿羊體外成熟卵母細(xì)胞的孤雌激活。
　　6.轉(zhuǎn)基因陽性細(xì)胞的體細(xì)胞核移植利用上述研究中建立的體細(xì)胞核移植程序，分別以綿羊成纖維細(xì)胞和轉(zhuǎn)蜘蛛拖絲蛋白基因細(xì)胞進(jìn)行體細(xì)胞核移植，其結(jié)果，正常綿羊體細(xì)胞融合率(72.7％)，與其相比，轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的

7、融合率(70.7％)，兩者差異不顯著，表明外源基因的轉(zhuǎn)入對早期核移植重構(gòu)胚的發(fā)育能力沒有顯著影響。
　　7.轉(zhuǎn)蜘蛛拖絲蛋白基因陽性細(xì)胞的體細(xì)胞重構(gòu)胚的發(fā)育能力
　　將采用體細(xì)胞核移植方法獲得的轉(zhuǎn)蜘蛛拖絲蛋白基因重構(gòu)胚進(jìn)行體外培養(yǎng)，其結(jié)果與正常的綿羊成纖維細(xì)胞通過體外發(fā)育桑椹胚的比率(13.8％)相比，轉(zhuǎn)基因陽性細(xì)胞的體細(xì)胞的核移植的體外發(fā)育至桑椹胚的比率(11.6％)，兩者之間的差異不顯著;將獲得的轉(zhuǎn)蜘蛛拖絲蛋白基因融合重構(gòu)