PTB-U-box靶向性降解胰島素樣生長因子受體和胰島素受體的腫瘤治療策略.pdf

1、惡性腫瘤長久以來都是國際上醫(yī)學(xué)研究的焦點,這種多因素導(dǎo)致的復(fù)雜疾病已經(jīng)嚴(yán)重威脅人類健康和生活。目前研究認(rèn)為,腫瘤的發(fā)生主要是由于癌基因的過度活化和(或)抑癌基因的功能缺失引起的。在這些過度活化的癌基因中,有很多作為腫瘤發(fā)生和演變的主要驅(qū)動因素,活躍于腫瘤發(fā)展的各個階段。其中受體型酪氨酸激酶(Receptor Tyrosine Kinase,RTK)就屬于推動細(xì)胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化和腫瘤進(jìn)程的重要因素。這類具有激酶活性的細(xì)胞膜表面受體也位于正常

2、細(xì)胞,當(dāng)與特異配體結(jié)合后,活化的激酶結(jié)構(gòu)域和磷酸化酪氨酸會向下游傳遞活化信號,激活一系列生長、發(fā)育和生存相關(guān)的通路。然而,在腫瘤細(xì)胞或者惡性轉(zhuǎn)化細(xì)胞中,這類分子往往呈過度表達(dá)和(或)持續(xù)活化狀態(tài),對腫瘤各種生物行為學(xué)表現(xiàn)起到至關(guān)重要的作用。因此,在特定的腫瘤細(xì)胞中,選取其賴以生存或者高度表達(dá)的RTK作為治療靶點,抑制其豐度和活性,對于此類腫瘤能夠起到關(guān)鍵的抑制作用。
　　胰島素樣生長因子受體(Insulin-like Growth

3、 Factor-1 Receptor,IGF-1R)和胰島素受體(Insulin Receptor,IR)已被證實在多種腫瘤中存在高表達(dá),參與細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化以及腫瘤細(xì)胞的發(fā)生發(fā)展,其產(chǎn)生的促進(jìn)生長和能量代謝效應(yīng)是腫瘤細(xì)胞生長和生存所必需。因此,目前許多藥物研發(fā)公司和實驗室將目光匯聚在這兩個RTK上。IGF-1R和IR同屬一個亞家族,具有60％的同源性,在細(xì)胞膜表面能夠形成同源二聚體,也能相互結(jié)合形成異源二聚體。特異配體與受體胞外段結(jié)合后

4、,可激活受體激酶活性,胞內(nèi)段特定的酪氨酸殘基發(fā)生磷酸化,隨后募集并結(jié)合下游接頭分子胰島素受體底物(Insulin Receptor Substrate,IRS),進(jìn)而激活PI3K和Ras,開啟AKT和MAPK信號通路的轉(zhuǎn)導(dǎo),介導(dǎo)細(xì)胞的生長和分化、葡萄糖的攝取和代謝等效應(yīng)。根據(jù)大量研究和文獻(xiàn)報道,現(xiàn)已證實IGF-1R和IR與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。目前,針對IGF-1R的靶向藥物包括抗體和小分子抑制劑也已經(jīng)開發(fā)并進(jìn)入臨床試驗階段,遺憾

5、的是,臨床III期的試驗結(jié)果令人沮喪,主要體現(xiàn)在IR對IGF-1R的代償,導(dǎo)致靶向干預(yù)效果不佳。此外,IGF-1R和IR與其它家族RTK成員組成的雜合受體,對于抗腫瘤藥引發(fā)的繼發(fā)耐藥也發(fā)揮重要作用,如IGF-1R和EGFR,IR與Met均可形成異源二聚體。因此,在克服這些問題的同時,開發(fā)新的治療策略,對于此類腫瘤的治療具有重要的臨床意義。
　　泛素介導(dǎo)的蛋白質(zhì)降解是細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)最主要的負(fù)向調(diào)節(jié)方式。該過程是在泛素激活酶E1、泛素結(jié)

6、合酶E2和泛素連接酶E3的協(xié)同作用下進(jìn)行的。結(jié)合泛素分子的底物蛋白隨后在蛋白酶體或溶酶體中降解。依靠泛素連接酶E3對底物蛋白特異的識別能力,決定了泛素介導(dǎo)的蛋白降解具有特異性。在本研究中,我們以IGF-1R和IR為靶點,選取了分子伴侶相關(guān)泛素連接酶CHIP(Carboxy terminus of Hsc70 Interacting Protein)的U-box結(jié)構(gòu)域作為功能結(jié)構(gòu)域,行使泛素化、降解功能;將IGF-1R和IR的胞內(nèi)接頭分子

7、IRS-1(Insulin Receptor Substrate-1)的磷酸化酪氨酸結(jié)合(phosphotyrosine binding,PTB)結(jié)構(gòu)域作為結(jié)合結(jié)構(gòu)域,發(fā)揮識別并結(jié)合特異底物蛋白的功能。利用分子克隆技術(shù),將二者在基因水平融合,構(gòu)建為重組泛素連接酶,旨在特異降解IGF-1R和IR,從而實現(xiàn)抑制腫瘤。
　　【目的】
　　1.明確重組泛素連接酶對特異底物蛋白IGF-1R和IR的降解功能;
　　2.揭示重組泛素

8、連接酶特異降解IGF-1R和IR的作用機(jī)制;
　　3.監(jiān)測重組泛素連接酶介導(dǎo)的靶蛋白降解而引起的腫瘤細(xì)胞生物學(xué)行為的改變;
　　4.初步評估重組泛素連接酶在動物水平抑制實體腫瘤生長的作用。
　　【方法和結(jié)果】
　　1.重組泛素連接酶PTB-U-box對IGF-1R和IR的特異降解
　　我們首先采用分子克隆技術(shù),構(gòu)建了重組泛素連接酶PTB-U-box,及其相應(yīng)的功能結(jié)構(gòu)域U-box缺失突變體PTB、功能結(jié)構(gòu)域

9、U-box突變體PTB-U-box(H260Q),將其分別導(dǎo)入IGF-1R和IR高表達(dá)的人肝癌細(xì)胞系HepG2、人宮頸癌細(xì)胞系HeLa以及人胰腺癌細(xì)胞系PANC-1,發(fā)現(xiàn)重組泛素連接酶PTB-U-box能夠有效下調(diào)IGF-1R和IR的蛋白水平,而無關(guān)受體EGFR、Met的蛋白水平不受影響。另外,通過實時定量PCR,證實重組泛素連接酶對靶蛋白的轉(zhuǎn)錄不產(chǎn)生影響,表明其作用于IGF-1R和IR轉(zhuǎn)錄后水平。
　　2.重組泛素連接酶特異降解

10、IGF-1R和IR的作用機(jī)制
　　我們通過IGF-1、胰島素或血清處理HepG2細(xì)胞,采用免疫沉淀檢測了不同處理條件下IGF-1R和IR的胞內(nèi)域磷酸化水平,證實了特異配體和血清處理均能使受體胞內(nèi)域活化。隨后選取轉(zhuǎn)染效率較高的HeLa細(xì)胞系為工具細(xì)胞,通過免疫共沉淀實驗,明確了僅含有磷酸化酪氨酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域的PTB以及重組泛素連接酶PTB-U-box均能夠與活化的受體結(jié)合;采用體內(nèi)泛素化實驗,驗證了重組泛素連接酶 PTB-U-box能

11、夠促進(jìn)活化受體發(fā)生泛素化,進(jìn)而使其降解的作用機(jī)制。而不含U-box的PTB和U-box突變的PTB-U-box(H260Q)則不能有效促發(fā)靶受體泛素化。
　　3.重組泛素連接酶介導(dǎo)的靶蛋白降解而引起的腫瘤細(xì)胞生物學(xué)行為的改變
　　IGF-1R和IR介導(dǎo)的信號通路在胞內(nèi)引起一系列生物學(xué)效應(yīng),主要與細(xì)胞的生長、生存和能量代謝密切相關(guān)。我們選取HepG2細(xì)胞,通過免疫印跡實驗,明確了PTB-U-box導(dǎo)致IGF-1R和IR下游信號

12、分子AKT和ERK的磷酸化水平降低,提示PTB-U-box能夠抑制IGF-1R和IR介導(dǎo)的信號通路;隨后在HeLa細(xì)胞和HepG2細(xì)胞中,通過MTT、Transwell等實驗檢測了腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲、凋亡的改變;在MCF-10A細(xì)胞細(xì)胞中,檢測了PTB-U-box過表達(dá)后E-cadherin、N-cadherin、Twist等EMT標(biāo)志分子和關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子水平的改變,初步探索了PTB-U-box對EMT過程的影響。這些實驗結(jié)果表明:重組

13、泛素連接酶PTB-U-box通過泛素化、降解活化的IGF-1R和IR,降低它們的細(xì)胞膜表面含量,弱化其所介導(dǎo)的信號通路,從而發(fā)揮抑制腫瘤細(xì)胞惡性表型的作用。
　　4.重組泛素連接酶在動物水平對實體腫瘤生長的抑制作用
　　鑒于以上實驗結(jié)果證實重組泛素連接酶PTB-U-box具有明確的體外抗腫瘤效應(yīng),我們構(gòu)建并包裝了攜帶PTB-U-box和不含U-box的PTB的腺病毒載體,即
　　Ad-PTB-U-box和Ad-PTB。

14、在驗證了該重組腺病毒的表達(dá)及其對靶受體的降解功能后,我們采用腫瘤原位注射的方法,在HepG2荷瘤裸鼠體內(nèi)評估了重組泛素連接酶對實體腫瘤生長的抑制情況,結(jié)果表明Ad-PTB-U-box能夠有效抑制裸鼠移植實體腫瘤的生長。通過這部分實驗,我們證實重組泛素連接酶PTB-U-box通過引發(fā)IGF-1R和IR蛋白泛素化降解,可有效抑制IGF-1R和IR高表達(dá)的腫瘤的在體生長。
　　5.重組泛素連接酶對腫瘤細(xì)胞葡萄糖代謝的影響
　　胰島

15、素(insulin)介導(dǎo)的葡萄糖代謝是細(xì)胞內(nèi)最主要的能量來源,細(xì)胞分解葡萄糖產(chǎn)生能量以滿足生長分化所需。在腫瘤細(xì)胞中,活躍的生長和增殖促使細(xì)胞發(fā)生代謝重編程,其中葡萄糖攝取高度活躍和有氧酵解是腫瘤細(xì)胞糖代謝的鮮明特征。在本部分實驗中,我們主要探索了重組泛素連接酶能否影響腫瘤細(xì)胞糖代謝。我們選取HepG2細(xì)胞,證實了重組泛素連接酶能夠抑制胰島素介導(dǎo)的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4(glucose transporter4)的細(xì)胞膜轉(zhuǎn)位,進(jìn)而降低腫瘤細(xì)胞

16、對葡萄糖的攝取,最終抑制糖酵解途徑產(chǎn)物乳酸和丙酮酸的生成。
　　【結(jié)論】
　　靶向IGF-1R和IR的重組泛素連接酶PTB-U-box,通過引發(fā)IGF-1R/IR泛素化、降解,導(dǎo)致其下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)削弱,可以有效地抑制IGF-1R/IR過表達(dá)的腫瘤細(xì)胞增
　　殖、侵襲、凋亡抵抗、糖有氧酵解等多種惡性表型,從而抑制荷瘤鼠在體腫瘤生長。該項基于接頭分子IRS-1構(gòu)建重組泛素連接酶的應(yīng)用型研究在國際上尚屬首次,具有一定的開創(chuàng)性。

17、
　　本課題研究,確認(rèn)了基于靶向性泛素化的重組PTB-U-box腫瘤治療策略的可行性。且通過分子、細(xì)胞和動物水平的機(jī)制研究和功能驗證,我們得以系統(tǒng)地、多層次地評價重組泛素連接酶PTB-U-box對腫瘤細(xì)胞生物學(xué)行為的影響作用,拓展了重組泛素連接酶的功能范圍,證實了重組泛素連接酶具有特異性和多靶點的優(yōu)勢。通過本課題研究,將泛素介導(dǎo)的蛋白質(zhì)降解從理論知識上升到實際應(yīng)用,并提供了成功的范例,因而可為腫瘤的靶向治療提供新的思路。此外,該研