胰島素樣生長因子2及受體參與角膜上皮細胞生長和創(chuàng)傷修復的研究.pdf

1、角膜上皮細胞層是眼球抵御外界有害致病因素侵犯的第一道屏障，在受到創(chuàng)傷后可以快速修復愈合，當愈合延遲時，會造成視力下降，嚴重時導致失明。目前部分臨床及動物實驗報道角膜上皮本身存在一定的自我更新及修復能力，但角膜損傷后發(fā)揮主要作用的并非角膜上皮而是來自于角膜緣的細胞組織，該組織中含有角膜緣干細胞(LSC)，角膜緣干細胞可以通過細胞增殖、分化及遷移來修復損傷的角膜組織。有報道稱角膜緣干細胞缺失時角膜的修復功能會受到限制，且角膜修復功能還與角膜

2、結膜化、新生血管生成、慢性炎癥刺激及持續(xù)性的角膜上皮損害等因素有密切關系，在上述因素等持續(xù)存在，角膜最終不能夠修復時可產生嚴重的后果即失明，同時研究表明，我們可通過移植角膜緣組織及角膜緣干細胞進行角膜損傷的治療，這提示了角膜緣干細胞組織在創(chuàng)傷角膜修復過程中發(fā)揮著重要作用。在角膜損傷后，角膜緣干細胞即開始增殖，并分化為過渡性細胞，這種細胞可遷移至損傷部位，誘導細胞表達角膜上皮細胞標記進而促進角膜損傷的修復。然而角膜上皮細胞與角膜緣干細胞組

3、織之間相互作用的分子通路及機制目前尚不清楚。
　　Jia等報道角膜機械或化學損傷后細胞中負責生長及分化的因子基因表達明顯增強，包括轉化生長因子α(TGF-α)、轉化生長因子β(TGF-β)、表皮生長因子(EGF)、肝素樣生長因子(HGF)、成纖維細胞生長因子β(FGF-β)等，這些因子均可由角膜上皮細胞生成，它們參與調節(jié)細胞的增殖與生長。此外，胰島素樣生長因子2(IGF2)也被證實能夠促使角蛋白細胞增殖，并使黏附連接蛋白N鈣黏附素

4、的生成增加，使細胞外基質增加，從而促使角蛋白膠原的生成。胰島素樣生長因子信號通路已被證實與細胞增殖及分化相關，在細胞及器官水平的生長調節(jié)中起重要作用，IGF及以上所述其他細胞調節(jié)因子與角膜緣干細胞的增殖、分化及遷移的發(fā)生有關。
　　胰島素樣生長因子家族(IGFs))是由兩種低分子多肽(IGF-1、IGF-2)、兩類特異性受體及六種結合蛋白組成。人體內許多組織都可以合成、分泌胰島素樣生長因子，但循環(huán)中的IGF則主要是由肝臟分泌的。胰

5、島素樣生長因子家族的生物學功能是通過與特異性的靶細胞表面的胰島素樣生長因子受體結合而實現(xiàn)的。已發(fā)現(xiàn)有兩種結構完全不同的IGF受體:IGF-1受體和IGF-2受體（即甘露糖6磷酸受體）分別又稱1型受體和2型受體。正常情況下，IGF與其結合蛋白的親和力大于或近似等于與其受體的結合，加之高親和力受體低表達，使少量游離IGF與大量IGF/IGFBP復合物處于平衡狀態(tài)。IGFs的合成與分泌受血液中生長激素水平的控制，循環(huán)中IGFs對生長激素的分泌

6、具有負反饋調節(jié)作用，從而形成了一個生長激素—胰島素樣生長因子軸，其對機體組織的分化、增殖及物質代謝具有重要的調節(jié)作用。以往研究表明，借助角膜上皮細胞表面的細胞表型標記細胞角蛋白K3及K12或連接蛋白43可對角膜緣干細胞與角膜上皮細胞進行區(qū)分，并且此類因子與角膜緣干細胞的增殖及分化亦相關，且還有研究報道說，角膜上皮細胞培養(yǎng)液的上層部分可促使多種干細胞包括毛囊于細胞、間充質干細胞及胚胎干細胞等，分化為攜帶角膜上皮細胞標記K12的細胞，但相關

7、的分子機制仍不清楚。
　　目的：
　　角膜創(chuàng)傷修復的過程通常包括細胞的激活、增殖、分化，細胞因子的釋放，細胞外基質的合成與重塑等，都是由多種細胞因子在時間和空間上高度協(xié)調而完成的。明確角膜損傷修復過程中關鍵的調控分子及其作用機制，對于角膜損傷后減少瘢痕形成、促進角膜愈合具有重要意義。本研究中我們利用小鼠角膜機械損傷模型對損傷后角膜上皮細胞與角膜緣干細胞間的相互作用分子機制進行初步探究。
　　方法：
　　構建小鼠單

8、側眼角膜機械損傷模型，對側角膜為對照組，不同時間點采集小鼠雙側角膜中央及角膜緣組織，進行細胞培養(yǎng)并基因檢測EGF、FGF-b、KGF、HGF、TGF-b1、IGF-1及IGF-2等細胞因子不同程度的反應性改變，探究這些細胞因子對角膜緣干細胞分化及成纖維細胞轉化的影響，并探討mTOR/STAT3信號通路在IGF-2調控角膜上皮細胞增殖分化過程中的作用。
　　結果：
　　1.角膜上皮損傷后，小鼠眨眼加劇，有畏光的現(xiàn)象，角膜上有不

9、規(guī)則的斑塊狀結構;對損傷角膜組織行蘇木精-伊紅(HE)染色后顯示，針尖破壞角膜上皮層，而基質層未受損，提示我們所采用的角膜機械損傷模型方法可行性良好。
　　2.中央角膜損傷后（0、3、6、12及24h）采集受損側小鼠角膜組織，實時PCR檢測相關細胞因子的基因表達，損傷后3h及6h EGF、FGF-b、KGF、HGF、TGF-b1、IGF-1及IGF-2的基因表達水平升高，IGF-2因子的水平損傷后3h最高，并且顯著高于其他各種檢測

10、的細胞因子(p＜0.05)。
　　3.角膜損傷后角膜緣干細胞組織較角膜上皮細胞中兩種受體的基因表達水平顯著增加，3h后其表達差異均具有統(tǒng)計學意義(p＜0.05)。
　　4.IGF-2對角膜上皮細胞的增殖有促進作用，并且隨著培養(yǎng)時間延長，IGF-2干預組的增殖能力與對照組比較有明顯的區(qū)別。從24h開始，IGF-2干預組的角膜上皮細胞遷移能力明顯高于對照組，48h更為明顯。通過對細胞骨架進行染色觀察，發(fā)現(xiàn)IGF-2組較對照組有更

11、強的粘附率。
　　5.胰島素樣生長因子2（IGF-2）在角膜損傷后迅速大量表達，同時促使角膜緣細胞IGF2受體的表達增加并誘導角膜緣干細胞分化為帶有K12標記的角膜上皮細胞。
　　6.免疫熒光染色分析顯示受損角膜組織細胞中α平滑肌肌動蛋白水平顯著增加，提示可能存在成纖維細胞向肌成纖維細胞的轉化。
　　7.檢測磷酸化mTOR與磷酸化STAT3蛋白表達的變化，發(fā)現(xiàn)p-mTOR與p-STAT3蛋白的表達均隨IGF-2濃度的增

12、加而增多。
　　8.使用IGF-2后，檢測EGF、FGF-b、KGF、HGF及TGF-b1等細胞因子損傷相關蛋白的表達變化，發(fā)現(xiàn)這幾個細胞因子在受到IGF-2刺激后，其蛋白表達水平均較對照組有顯著的升高，但當同時再給予mTOR/STAT3信號通路抑制劑RAPA50μ mol/L后，發(fā)現(xiàn)上述幾個細胞因子的蛋白表達被明顯抑制。
　　結論：
　　1.小鼠單側眼角膜機械損傷模型具有可重復性，角膜上皮能完全修復，模型制作成功，可

13、用于對角膜上皮損傷修復過程的研究。
　　2.角膜機械損傷后角膜上皮中IGF-2因子表達明顯上調，角膜緣組織中IGF-2受體表達增加，其共同作用促使角膜緣干細胞向角膜上皮細胞轉化，同時在成纖維細胞向肌成纖維細胞的轉化中起一定的作用，對角膜損傷修復有促進作用。
　　3.在體外培養(yǎng)狀態(tài)下，特異性的阻斷mTOR/STAT3信號通路可以阻斷IGF-2對角膜上皮細胞的修復作用，IGF-2對角膜上皮細胞修復的這種效應可能是通過激活mTOR