水稻根cDNA文庫中抗菌蛋白-肽編碼基因的篩選研究.pdf

1、作為防御系統(tǒng)的一部分，生物(包括植物)產(chǎn)生各種化合物來防御病原物的入侵。這些化合物包括蛋白和肽。鑒別并了解這些化合物及其在防御反應(yīng)中的作用將可以更好的研究生物抗病的機(jī)理。 然而，目前發(fā)現(xiàn)這些肽和蛋白及其編碼基因的方法非常繁瑣，包括蛋白提取、純化、生物實(shí)驗(yàn)和基因克隆等，從而限制了新的編碼抗菌肽/蛋白(AMP)的基因發(fā)現(xiàn)。 本研究以微孔濾膜為支持介質(zhì)，以菌體染色為鑒別手段，從cDNA文庫中篩選可能編碼抗菌肽的基因，克隆基因后

2、進(jìn)行蛋白質(zhì)的體外表達(dá)，進(jìn)而開展抗菌活性的鑒定。從水稻根cDNA表達(dá)文庫的約3×104個(gè)克隆出發(fā)，初篩得到了300多個(gè)候選克隆，進(jìn)一步經(jīng)過固體涂板驗(yàn)證、液體抑菌活性測(cè)定，確定其中57個(gè)為進(jìn)一步驗(yàn)證的陽性克隆。將這些陽性克隆提取質(zhì)粒，分別轉(zhuǎn)化到大腸桿菌菌株XL1-Blue、DH5ct、BL21(DE3)pLysS、ER2566中進(jìn)行抗菌活性鑒定，根據(jù)對(duì)不同細(xì)菌菌株的抗性，可將這些克隆分為四類：第1類是四種菌中染色都為藍(lán)色的克隆；第1I類是三

3、種菌中染色為藍(lán)色的克隆，依此類推。對(duì)陽性克隆進(jìn)行5’端測(cè)序，然后進(jìn)行BlastX分析，結(jié)果表明有些序列編碼已知的抗菌肽，如脂轉(zhuǎn)移蛋白；有些序列編碼抗性相關(guān)蛋白，如LEA蛋白；有些序列編碼的蛋白與細(xì)菌自身蛋白相似，可能對(duì)細(xì)菌的正常生理功能有干擾作用；此外，我們還篩選獲得了一些功能未知的克隆。 為了進(jìn)一步鑒定這些克隆的功能，我們對(duì)部分篩選到的蛋白質(zhì)編碼基因克隆到了高表達(dá)載體pET32a、pET28a和pETlla中，主要結(jié)果如下：