從蛋白表達(dá)譜的改變研究化學(xué)致癌劑MNNG誘發(fā)細(xì)胞應(yīng)答反應(yīng)的量效及時(shí)效關(guān)系.pdf

1、單功能烷化劑N-甲基-N-硝基-N-亞硝基胍(MNNG)是一種在實(shí)驗(yàn)室中普遍使用的模式化學(xué)誘變劑和致癌劑,用于研究環(huán)境中廣泛存在的Ⅳ.亞硝胺類誘變劑和致癌劑的致癌機(jī)制.它能和DNA及蛋白質(zhì)等生物大分子形成加合物(adduct),這些加合物最終可能導(dǎo)致染色體異常,點(diǎn)突變和細(xì)胞死亡.其引起的與突變有關(guān)的主要DNA損傷類型是O<'6>-甲基鳥嘌呤,這種損傷與許多腫瘤的發(fā)生密切相關(guān).此外,環(huán)境誘變劑引起的突變也可發(fā)生在非DNA損傷部位,即非定標(biāo)

2、性突變(nontargctcd mutagenesis).我們實(shí)驗(yàn)室就曾用一個(gè)特殊的突變檢測(cè)系統(tǒng)直接證明了低濃度(0.2μM)的短壽烷化劑MNNG(半壽期為1.1hr)可在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中誘發(fā)非定標(biāo)性突變,且這種非定標(biāo)性突變依賴于基因表達(dá)的改變.本實(shí)驗(yàn)室還證明了在低濃度MNNG處理下發(fā)生了廣泛的細(xì)胞反應(yīng):DNA復(fù)制保真度的下降和DNA聚合酶譜的改變:細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路cAMP-PKA-CREB和JNK/SAPK被激活;細(xì)胞表面受體如表皮生長(zhǎng)

3、因子受體EGFR、腫瘤壞死因子受體TNFR發(fā)生聚簇;EGFR信號(hào)通路發(fā)生阻斷:內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)的發(fā)生等. 為了進(jìn)一步了解化學(xué)致癌物誘發(fā)哺乳動(dòng)物細(xì)胞應(yīng)答反應(yīng)的全貌,本實(shí)驗(yàn)室還利用了高通量的蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)對(duì)低濃度MNNG處理后細(xì)胞基因表達(dá)譜的改變進(jìn)行了初步研究.結(jié)果發(fā)現(xiàn)有60多個(gè)蛋白斑點(diǎn)發(fā)生了變化,其中有36個(gè)被成功鑒定.這些被鑒定蛋白的功能涉及非常廣泛,更提示了我們細(xì)胞應(yīng)答反應(yīng)的復(fù)雜性.同時(shí)我們考慮到細(xì)胞的應(yīng)答反應(yīng)往往是連續(xù)的、動(dòng)態(tài)

4、的,如果我們只孤立地研究某個(gè)作用點(diǎn)時(shí)的反應(yīng)情況可能是不夠的,因此進(jìn)行不同濃度的量效研究和不同時(shí)間的時(shí)效研究就顯得十分必要了. 主要結(jié)果: 1.在本研究中,首先根據(jù)已有的研究成果和相關(guān)文獻(xiàn)確定了低(0.25μM)、中(lμM)、高(10μM)三個(gè)不同的MNNG處理劑量,經(jīng)蛋白質(zhì)組學(xué)的大規(guī)模篩選后發(fā)現(xiàn)共有85個(gè)蛋白斑點(diǎn)發(fā)生了顯著的變化,并且成功鑒定了其中的71個(gè),鑒定成功率為83.5﹪.這些蛋白的功能涉及轉(zhuǎn)錄調(diào)控、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、

5、代謝、DNA修復(fù)和細(xì)胞周期調(diào)控等.我們發(fā)現(xiàn),在這些得到成功鑒定的蛋白中,僅有少數(shù)的蛋白在不同濃度MNNG處理后都有表達(dá)水平的改變,其它絕大多數(shù)蛋白表達(dá)水平的改變?cè)诓煌瑵舛冉M是相對(duì)獨(dú)立的.這說明處理劑量與效應(yīng)之間并不是單純的線性關(guān)系,高濃度處理組并不是低濃度處理組的簡(jiǎn)單放大.此外,值得注意的是隨著處理濃度的增高,表達(dá)上調(diào)蛋白的比例減小,而表達(dá)下調(diào)蛋白的比例卻增加.我們認(rèn)為這和處理濃度增高后細(xì)胞毒性作用的增強(qiáng)是密切相關(guān)的. 2.經(jīng)過

6、量效研究后,選擇了對(duì)細(xì)胞毒性作用相對(duì)較小而細(xì)胞反應(yīng)相對(duì)較明顯的中濃度(lμM)處理劑量進(jìn)行下一步的時(shí)效研究.選擇MNNG處理后分別恢復(fù)3小時(shí)、12小時(shí)和24小時(shí)的細(xì)胞展開了蛋白質(zhì)組學(xué)的分析.結(jié)果找到了78個(gè)差異表達(dá)點(diǎn),其中的64個(gè)蛋白點(diǎn)得到了鑒定,鑒定成功率為82﹪.為了盡可能多的鑒定差異表達(dá)蛋白,我們又運(yùn)用了合作研究的成果--微流控固相萃取(solid-phase extracfion,SPE)裝置,將鑒定成功率提高到了90﹪.這些得

7、到成功鑒定的蛋白質(zhì)的功能主要涉及細(xì)胞周期調(diào)控、代謝和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等.從結(jié)果中看,差異表達(dá)蛋白的數(shù)量在12小時(shí)組達(dá)到最多,而24小時(shí)組不僅數(shù)量最少而且改變的幅度都比較小.這說明細(xì)胞對(duì)環(huán)境有毒刺激的應(yīng)激反應(yīng)可能主要集中在12小時(shí)左右或以內(nèi),在此后更長(zhǎng)的時(shí)間(如24小時(shí)左右)細(xì)胞已經(jīng)逐漸恢復(fù)并度過應(yīng)激狀態(tài)了. 3.結(jié)合低濃度MNNG處理細(xì)胞后培養(yǎng)上清的蛋白質(zhì)組學(xué)分析結(jié)果,我們發(fā)現(xiàn)核型dUTP焦磷酸酶蛋白在細(xì)胞裂解總蛋白的差異蛋白圖譜中發(fā)生

8、下調(diào),同時(shí)又出現(xiàn)在細(xì)胞外液中.結(jié)果的準(zhǔn)確性經(jīng)Western blot方法證明.提示該蛋白可以作為監(jiān)測(cè)人群接觸環(huán)境致癌物后有效的早期生物標(biāo)記物. 4.由于細(xì)胞在應(yīng)對(duì)環(huán)境有害因素刺激時(shí)很多信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的激活及重要反應(yīng)事件的發(fā)生都要通過細(xì)胞核,所以細(xì)胞核內(nèi)蛋白的改變也是我們關(guān)注的重點(diǎn)之一.由于細(xì)胞總蛋白提取液中含有的大部分是胞漿內(nèi)的可溶蛋白,而核蛋白因?yàn)橄鄬?duì)豐度較低可能覆蓋不全,因此我們又分析了低(0.25μM)、中(1μM)濃度M

9、NNG處理后細(xì)胞核蛋白的差異圖譜,并且采用了準(zhǔn)確性更高、上樣量更低的熒光差異雙向凝膠電泳(2-D DIGE)技術(shù).經(jīng)過比對(duì),我們發(fā)現(xiàn)共有24個(gè)蛋白點(diǎn)的含量發(fā)生了改變,其中18個(gè)蛋白點(diǎn)被成功鑒定.這些蛋白大部分屬于14-3-3蛋白家族、異質(zhì)性胞核核糖核蛋白(hnRNPs)家族和結(jié)構(gòu)蛋白家族.值得一提的是,盡管低、中濃度MNNG處理后細(xì)胞總蛋白的差異圖譜中共同的蛋白很少,但在核蛋白的研究中卻發(fā)現(xiàn)24個(gè)差異蛋白點(diǎn)中有10個(gè)蛋白是相同的,這提示

10、我們低、中濃度MNNG處理后細(xì)胞發(fā)生的核內(nèi)事件中有共同之處. 5.差異表達(dá)蛋白質(zhì)的Western blot驗(yàn)證:從成功得到質(zhì)譜鑒定的蛋白質(zhì)中,選擇RanGAP1、14-3-3 β和14-3-3 ε進(jìn)行Western blot驗(yàn)證.結(jié)果表明Western blot分析得到的結(jié)桌與蛋白質(zhì)組學(xué)的結(jié)果基本一致,說明本實(shí)驗(yàn)中蛋白質(zhì)組學(xué)的分析結(jié)果是可信的. 主要結(jié)論: 1.通過對(duì)暴露于化學(xué)致癌劑MNNG后哺乳細(xì)胞量效及時(shí)效

11、反應(yīng)的蛋白質(zhì)組學(xué)研究,分別發(fā)現(xiàn)了85個(gè)和78個(gè)蛋白的表達(dá)量發(fā)生了改變,說明MNNG作用后細(xì)胞內(nèi)發(fā)生了廣泛而復(fù)雜的變化,有眾多蛋白參與了應(yīng)答反應(yīng),這些蛋白涉及到細(xì)胞的不同功能. 2.研究發(fā)現(xiàn)僅有極少數(shù)蛋白有劑量依賴關(guān)系和時(shí)間依賴關(guān)系,說明不同濃度MNNG暴露及暴露不同時(shí)間后細(xì)胞應(yīng)答反應(yīng)機(jī)制是不一樣的,高濃度MNNG作用后,細(xì)胞應(yīng)答反應(yīng)體系不是低濃度作用后的簡(jiǎn)單放大,存在更為復(fù)雜的致毒機(jī)制;不同濃度MNNG作用不同時(shí)間后,可能先后依

12、次激活細(xì)胞內(nèi)的不同通路來誘發(fā)其應(yīng)答反應(yīng)和產(chǎn)生毒性效應(yīng). 3.結(jié)合低濃度MNNG處理細(xì)胞后培養(yǎng)上清的蛋白質(zhì)組學(xué)分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)的核型dUTP焦磷酸酶蛋白,可以作為監(jiān)測(cè)人群接觸環(huán)境致癌物后可能的早期生物標(biāo)志物. 4.對(duì)低、中濃度MNNG處理后細(xì)胞核蛋白差異圖譜的進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn),14-3-3蛋白家族和異質(zhì)性胞核核糖核蛋白(hnRiPs)家族發(fā)生了較為明顯的改變.并且兩個(gè)濃度的核蛋白差異圖譜具有較大的相似性,這提示我們低、中濃度MN