Survivin shRNA與大黃素聯(lián)合應用抗卵巢癌治療實驗研究.pdf

1、目的：
　　在女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤中，卵巢癌(Ovarian cancer, OC)發(fā)病率居第二位，死亡率居首位。卵巢癌通常發(fā)現(xiàn)時已屬晚期，且患者易對化療藥物產(chǎn)生耐藥，導致治療效果不理想，已成為女性生殖系統(tǒng)腫瘤中死亡率最高的惡性腫瘤。隨著診斷手段的提高以及治療方法的進步，卵巢癌患者病情獲得一定緩解，但總體預后并不理想，五年生存率仍低于50％，晚期患者不到30％。因此，卵巢癌的治療是婦科腫瘤學界面臨的一個重大難題和嚴峻挑戰(zhàn)，迫切需要

2、尋找特異性強且患者能夠耐受的治療方法。
　　Survivin是凋亡抑制蛋白（Inhibitor of apoptosis protein, IAP）家族中的一員，它在細胞凋亡和分化中扮演重要角色，具有抑制細胞凋亡和調(diào)節(jié)細胞增殖的雙重功能，對細胞周期起調(diào)控作用。研究發(fā)現(xiàn)Survivin在成人分化成熟的正常組織中幾乎無表達，在胎盤、胸腺組織以及結腸上皮基底部細胞等快速分裂的正常細胞中少量表達，而在腺癌、肺癌、結腸癌、卵巢癌、前列腺癌、

3、淋巴瘤等大多數(shù)惡性腫瘤組織中高表達。 Survivin在腫瘤細胞中表達特異性強而在正常組織不表達的特點，使它現(xiàn)已成為腫瘤診斷和治療的理想的靶點，如何靶向Survivin的治療成為近年來研究的熱點。
　　大黃素(Emodin)是一種蒽醌類物質(zhì)，是從大黃屬、寥屬、鼠李屬和番瀉葉中分離出來的主要有效單體。大黃素在臨床上具有多種藥理學活性，包括抗菌、抗炎、舒張血管、免疫抑制和抑制潰瘍形成等。近年來，大黃素的抗腫瘤作用逐漸成為研究的熱點。已

4、有研究發(fā)現(xiàn)大黃素能夠抑制多種惡性腫瘤細胞的生長并誘導凋亡，其中包括肝癌、肺癌、乳腺癌、宮頸癌和白血病等。
　　因此，本課題將靶向Survivin基因的腫瘤分子靶向治療技術與中藥治療相結合，探討靶向Survivin基因的短發(fā)夾RNA(small harpin RNA，shRNA)與大黃素聯(lián)合應用抗卵巢癌治療的效果，旨在為抗卵巢癌治療提供客觀、科學的理論基礎和實驗依據(jù)，從而為卵巢癌的臨床治療開辟有效的新途徑。
　　材料和方法：<

5、br>　　1.本實驗的研究對象為人卵巢癌細胞系SKOV3和HO8910。
　　2.構建攜帶靶向Survivin基因的shRNA質(zhì)粒載體，通過脂質(zhì)體法將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到卵巢癌細胞中。轉(zhuǎn)染成功后，通過熒光顯微鏡觀察綠色熒光蛋白的表達來檢測質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染效率。
　　3.按實驗設計進行分組，通過實時熒光定量PCR(Real time PCR)技術觀察Survivin mRNA在不同組別中的表達水平。
　　4.通過蛋白質(zhì)印跡法(Weste

6、rn blot)檢測Survivin蛋白在不同組別中的表達水平。
　　5.通過MTT法檢測細胞增殖活性，觀察Survivin shRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染與大黃素對卵巢癌細胞的生長抑制作用。
　　6.流式細胞儀(Flow cytometry，F(xiàn)CM)檢測Survivin shRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染與大黃素聯(lián)合應用對卵巢癌細胞的凋亡誘導作用。
　　7.使用Transwell小室，通過細胞體外侵襲實驗觀察Survivin shRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染

7、與大黃素聯(lián)合應用對卵巢癌細胞的侵襲能力的影響。
　　結果：
　　1.倒置熒光顯微鏡下觀察Survivin shRNA質(zhì)粒在SKOV3和HO8910細胞中的轉(zhuǎn)染效率約為60-70％。
　　2.Real timePCR結果顯示，Survivin shRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后SKOV3和HO8910細胞中Survivin mRNA表達水平明顯下降，與空白對照組比較差別明顯(P＜0.05)。
　　3.Western blot實驗

8、結果顯示，Survivin shRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后SKOV3和HO8910細胞中Survivin蛋白表達水平明顯下降，與real time PCR結果一致。
　　4.Survivin shRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染能夠有效降低卵巢癌細胞的增殖率，與空白對照組比較差別明顯(P＜0.05);大黃素對卵巢癌細胞的生長抑制作用呈濃度和時間依賴模式，大黃素60μM組與空白對照組比較差別明顯(P＜0.05); Survivin shRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染與大黃素聯(lián)

9、合應用能夠進一步抑制卵巢癌細胞的生長，與單藥應用組差別顯著(P＜0.05)。
　　5.Survivin shRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染能夠明顯誘導卵巢癌細胞發(fā)生凋亡，大黃素60μM同樣具有誘導卵巢癌細胞發(fā)生凋亡的作用，與空白對照組相比差別顯著(P＜0.05); Survivin shRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染與大黃素聯(lián)合應用能夠進一步增加卵巢癌細胞的凋亡率，與單藥應用組差別顯著(P＜0.05)。
　　6.在細胞侵襲實驗中，Transwell結果顯示

10、，Survivin shRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染與大黃素60μM均能夠抑制卵巢癌細胞的侵襲能力，二者聯(lián)合應用后卵巢癌細胞的侵襲能力明顯被抑制，與單藥應用組差別顯著(P＜0.05)。
　　結論：
　　1.Survivin shRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染能夠抑制卵巢癌細胞生長，誘導卵巢癌細胞凋亡，降低卵巢癌細胞的體外侵襲能力。
　　2.一定濃度的大黃素對能夠抑制卵巢癌生長，誘導卵巢癌細胞發(fā)生凋亡，降低卵巢癌細胞的體外侵襲能力。
　　3.S