黃芩苷對支氣管哮喘的藥效學及其對苦味受體作用機制研究.pdf

1、目的:研究中藥單體成分黃芩苷對治療支氣管哮喘的藥效學考察，并初步探討其對苦味受體的作用機制。
　　 方法:
　　 1、霧化吸入法測定黃芩苷對豚鼠引喘潛伏期的影響。
　　 2、離體氣管片法測定不同濃度黃芩苷對豚鼠氣管舒張作用。
　　 3、耳腫脹法測定黃芩苷的抗炎作用。
　　 4、MTT法檢測黃芩苷對HBSMC細胞活性影響。
　　 5、血常規(guī)測定不同濃度(5、10、25mg/ml)黃芩苷對哮喘

2、模型大鼠血液中WBC、NEUT％、EO％、BASO％的影響。
　　 6、HPLC測定霧化吸入10mg/ml黃芩苷1h后，不同時間段(0.Sh、1h、2h、4h、8h、24h、48h)小鼠肺臟和血液中黃芩苷濃度。
　　 7、構(gòu)建pcDNA3.1(+)/GFP/hTAS2R14質(zhì)粒并轉(zhuǎn)染HBSMC細胞，熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率，瓊脂糖凝膠電泳法驗證hTAS2R14在HBSMC細胞上的表達情況。
　　 8、pcDNA3

3、.1(+)/GFP/hTAS2R14質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293T細胞，熒光素酶法檢測不同濃度(10-9～10-4mol/L)黃芩苷對hTAS2R14表達影響。9激光共聚焦鈣離子成像法檢測黃芩苷(1mmol/ml)對已轉(zhuǎn)染hTAS2R14基因的HEK293T細胞內(nèi)鈣離子濃度影響。
　　 結(jié)果:
　　 1、黃芩苷對豚鼠引喘潛伏期的影響
　　 霧化吸入法測定引喘潛伏期實驗發(fā)現(xiàn)，給藥后各組引喘潛伏期均有不同程度延長，但黃芩苷組

4、與陽性藥組較正常對照組延長時間更長，同時，黃芩苷組（5mg/ml黃芩苷水溶液）的引喘潛伏期時間顯著高于陽性藥組（5mg/ml沙丁胺醇溶液）。
　　 2、不同濃度黃芩苷對豚鼠氣管舒張作用
　　 氣管片張力實驗測定黃芩苷對豚鼠氣管舒張作用發(fā)現(xiàn)，黃芩苷高劑量組對乙酰膽堿刺激收縮的豚鼠離體氣管片舒張率略低于多索茶堿組（為43.07％)，且舒張趨勢較多索茶堿組平緩，但舒張作用持續(xù)時間長于多索茶堿。黃芩苷低劑量組對正常氣管無舒張作用

5、，但也可在一定程度上舒張被乙酰膽堿刺激收縮的豚鼠離體氣管片，最大舒張率為24.63％，且具有劑量依賴性。
　　 3、黃芩苷的抗炎作用
　　 小鼠耳腫脹法測定黃芩苷對小鼠的抗炎作用，通過測定耳片厚度發(fā)現(xiàn)黃芩苷(10mg/ml)能夠有效對抗二甲苯所致的小鼠耳腫脹，給藥后不同時間段(1h、2h、6h)黃芩苷組小鼠耳片厚度均低于模型組，其作用效果與陽性藥（皮炎平軟膏）組相比，1h、6h黃芩苷組抗炎作用效果略低于陽性藥組，2h黃芩

6、苷組抗炎作用與陽性藥組基本持平。測定給藥后各組小鼠臟器指數(shù)發(fā)現(xiàn)，黃芩苷組耳片指數(shù)差介于陽性藥組與模型組之間;脾指數(shù)與陽性藥組持平，均低于模型組;胸腺指數(shù)三組間無顯著性差異。
　　 4、黃芩苷對HBSMC細胞活性影響
　　 MTT法測定發(fā)現(xiàn)，黃芩苷對HBSMC細胞活性無抑制作用(IC50＞100μM)。
　　 5、黃芩苷對哮喘模型大鼠血液中WBC、NEUT％、EO％、BASO％的影響
　　 通過檢測不同劑量

7、黃芩苷（5、10、25 mg/ml）干預哮喘模型大鼠血液中WBC、NEUT％、EO％、BASO％，發(fā)現(xiàn)模型組大鼠各項血液指標均與正常組大鼠有顯著性差異(p＜0.01)，同時黃芩苷中劑量組(10mg/ml)與模型組各項大鼠血液指標亦存在顯著性差異(p＜0.01)，提示哮喘大鼠模型建立成功，且中劑量黃芩苷對哮喘模型大鼠有一定的保護作用。
　　 6、霧化吸入黃芩苷后，不同時間段小鼠肺臟和血液中藥物濃度
　　 在本色譜條件下黃芩

8、素與內(nèi)標化合物分離良好，黃芩苷在0.5～95mg/L內(nèi)呈線性關(guān)系;黃芩苷的最低檢測濃度為0.05mg/L。測定黃芩苷(10mg/ml)霧化吸入1h后，48小時內(nèi)小鼠肺臟中的代謝曲線，我們發(fā)現(xiàn)黃芩苷濃度在給藥后0.5h首次出現(xiàn)最大值(46.57±0.52mg/L)，之后濃度隨時間逐漸降低，2h開始逐漸升高，至4h黃芩苷濃度達到第二次高峰（21.67±0.35mg/L），但至48h代謝完全，殘留量趨于零。同時測定黃芩苷在小鼠血液中代謝曲線，

9、我們發(fā)現(xiàn)黃芩苷在小鼠體內(nèi)血藥濃度在2h達到峰值(4.87±0.54 mg/L)，之后稍有下降，至4h后逐漸升高，8h后血藥濃度趨于平穩(wěn)(3.58～3.54mg/L)，至48h略有升高（4.76±0.23mg/L）。
　　 7、構(gòu)建pcDNA3.1(+)/GFP/hTAS2R14質(zhì)粒并轉(zhuǎn)染HBSMC細胞，觀察轉(zhuǎn)染效率，驗證hTAS2R14在HBSMC細胞上的表達情況
　　 熒光顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)該質(zhì)粒能夠成功轉(zhuǎn)染HBSMC

10、細胞，轉(zhuǎn)染效率大于60％,提取細胞中質(zhì)粒，紫外分光光度計檢測發(fā)現(xiàn)所提質(zhì)粒純度良好，濃度適中，PCR反應(yīng)結(jié)果驗證所合成的含目的基因的質(zhì)粒表達良好，且轉(zhuǎn)染效率較高，轉(zhuǎn)染條件可用;同時還發(fā)現(xiàn)未被轉(zhuǎn)染的HBSMC細胞中亦含有hTAS2R14基因。
　　 8、pcDNA3.1(+)/GFP/hTAS2R14質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293T細胞，檢測黃芩苷對hTAS2R14表達影響
　　 測定已轉(zhuǎn)染目的基因的HEK293T細胞在不同濃度(10

11、-9～10-4)黃芩苷刺激后熒光強度變化，發(fā)現(xiàn)熒光強度在10-6～10-4濃度范圍內(nèi)明顯增大，且熒光強度與藥物濃度存在一定的劑量依賴性，提示黃芩苷可能作用于目的基因hTAS2R14，并促進其表達。
　　 9、黃芩苷對已轉(zhuǎn)染hTAS2R14基因的HEK293T細胞內(nèi)鈣離子濃度影響
　　 黃芩苷（1mmol/L）對已轉(zhuǎn)染目的基因的HEK293T細胞刺激后，應(yīng)用激光共聚焦鈣離子成像法動態(tài)記錄細胞內(nèi)鈣離子濃度變化，我們發(fā)現(xiàn)在給予

12、黃芩苷刺激后，HBSMC細胞內(nèi)鈣離子濃度在0～5s內(nèi)迅速增高，在5～40s緩慢降低至初始濃度。
　　 結(jié)論:黃芩苷在治療支氣管哮喘的過程中，具有良好的體內(nèi)外抗炎效果和氣管松弛作用，在作用過程中對支氣管平滑肌無損傷作用;霧化吸入后在肺臟中代謝迅速，殘留量低;單次給藥后在較長時間內(nèi)，能夠維持穩(wěn)定的血藥濃度。同時能夠通過苦味受體這一新的途徑，間接調(diào)節(jié)細胞內(nèi)鈣離子通道，舒張支氣管平滑肌。
　　 因此，中藥單體成分黃芩苷是一個具有