BMPs信號通路在壓力調(diào)控BMSCs-PRF雙膜復(fù)合體成軟骨響應(yīng)中作用的研究.pdf

1、軟骨的畸形、缺損是臨床常見疾病之一,由于不含神經(jīng)、血管等組織,軟骨再生能力極差,怎樣修復(fù)軟骨組織缺損一直以來是臨床難以解決的問題。目前,組織工程技術(shù)的出現(xiàn)有望解決這一難題,通過選擇適當?shù)姆N子細胞、生長因子、支架材料及適宜的生長環(huán)境,利用軟骨組織工程技術(shù)已在體內(nèi)外構(gòu)建出具有一定形態(tài)的軟骨組織,并有臨床可行性。骨髓間充質(zhì)干細胞(Bone Marrow Mesenchymal Stemcells,BMSCs)具有很強的增殖能力及多向分化潛能,

2、可在一定的環(huán)境下誘導(dǎo)分化為軟骨細胞,可作為種子細胞廣泛應(yīng)用于軟骨再生修復(fù)。富血小板纖維蛋白(Platelet-richfibrin,PRF)作為一種富含血小板和白細胞的生物材料,含有多種生長因子的同時為細胞的遷移、黏附提供了場所。本課題組前期采用我們的專利技術(shù)將PRF膜片與BMSCs膜片復(fù)合后,成功構(gòu)建BMSCs/PRF雙膜復(fù)合體移植材料,并證實該復(fù)合體在適宜的體內(nèi)外環(huán)境中可以成功生成組織工程軟骨進而在軟骨再生與修復(fù)中具有良好的應(yīng)用前景

3、。另外,由于關(guān)節(jié)軟骨在體內(nèi)不可避免地要受到生物力刺激,力學(xué)刺激影響軟骨細胞的代謝與生長因子分泌,并在關(guān)節(jié)軟骨的生長、發(fā)育以及結(jié)構(gòu)與功能維持的過程中起重要的作用,一旦軟骨組織工程種子細胞在體外培養(yǎng)時缺乏有效的生物力刺激,會導(dǎo)致所生成的軟骨組織細胞排列不規(guī)則、軟骨基質(zhì)含量少,并且所含的膠原纖維較細,所構(gòu)建的組織工程軟骨力學(xué)性能也就較差且形態(tài)不佳,無法達到成功修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨缺損的目的。因而,本課題組前期通過對PCNA、Sox-9、Aggreca

4、n、Col-Ⅱ基因表達水平的檢測,已篩選出適當?shù)牧W(xué)刺激加載方式,即120KPa、1h/d、連續(xù)4d的靜態(tài)液壓加載,當該力學(xué)刺激作用于BMSCs/PRF雙膜復(fù)合體后,在體外可顯著地促BMSCs成軟骨分化;并通過裸鼠皮下以及關(guān)節(jié)軟骨缺損區(qū)移植證明,該力學(xué)刺激的預(yù)調(diào)可以明顯促進BMSCs/PRF雙膜復(fù)合體的體內(nèi)成軟骨能力。骨形態(tài)發(fā)生蛋白(Bone morphogenetic protein,BMPs)是從骨基質(zhì)中分離得到的一類酸性糖蛋白,能

5、高效誘導(dǎo)骨及軟骨組織的發(fā)生,BMPs不僅是有效的促軟骨分化因子同時也是敏感的力學(xué)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子,BMPs信號通路在軟骨形成過程中有著重要的作用。那么,在本研究前期所觀察到的壓力促BMSCs/PRF雙膜復(fù)合體成軟骨分化的過程中,BMPs信號是否參與了力學(xué)信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)?BMPs信號與壓力促BMSCs/PRF雙膜復(fù)合體成軟骨響應(yīng)有著怎樣的關(guān)系呢?本實驗即通過構(gòu)建BMSCs/PRF雙膜復(fù)合體,繼而模擬體內(nèi)受力環(huán)境,從分子學(xué)角度出發(fā),觀察壓力刺激兔B

6、MSCs/PRF雙膜復(fù)合體后BMPs信號相關(guān)分子的表達,探討B(tài)MPs在壓力調(diào)控兔BMSCs/PRF成軟骨響應(yīng)過程中的具體作用及其信號途徑,以期待從BMPs信號角度揭示壓力刺激BMSCs/PRF雙膜復(fù)合體成軟骨效應(yīng)中的力學(xué)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制。
　　本研究分為三個部分:
　　第一部分:利用骨髓穿刺法抽取兔骨髓血,通過密度梯度離心法分離、培養(yǎng)兔BMSCs并行形態(tài)學(xué)觀察至P3代,經(jīng)流式細胞術(shù)鑒定和多向分化誘導(dǎo)實驗(成骨分化和成脂分化),確

7、定本實驗所培養(yǎng)的兔BMSCs具有組織工程種子細胞的特點。將BMSCs培養(yǎng)至P3代,通過膜片誘導(dǎo)液誘導(dǎo)10-14d后,成功構(gòu)建出細胞膜片結(jié)構(gòu);抽取自體兔耳中央動脈血10ml,以3000r/min離心10min、靜置10-15min,獲取PRF凝膠,擠出多余液體后可獲PRF膜片結(jié)構(gòu);按照本課題組前期申請的國家發(fā)明專利(實質(zhì)審查階段):一種干細胞膜片片段復(fù)合富血小板纖維蛋白膜雙膜復(fù)合體移植材料的制備方法,將自體BMSCs膜片與自體PRF復(fù)合形

8、成BMSCs/PRF雙膜復(fù)合體。
　　第二部分:BMSCs/PRF雙膜復(fù)合體采用課題組自行研發(fā)制作的細胞液壓加載裝置,按照前期篩選出的對體外培養(yǎng)BMSCs/PRF雙膜復(fù)合體能夠產(chǎn)生良好促軟骨分化效應(yīng)的生物力學(xué)刺激條件:120KPa、1h/d、連續(xù)4d靜態(tài)液壓分別對BMSCs和BMSCs/PRF雙膜復(fù)合體進行加載,無壓力刺激時,BMSCs/PRF雙膜復(fù)合體和BMSCs膜片在常規(guī)培養(yǎng)液培養(yǎng)4d,通過Real-timePCR和Weste

9、rnBlot技術(shù),檢測BMPs信號通路相關(guān)分子基因和蛋白情況的表達。結(jié)果顯示:120KPa、1h/d、連續(xù)4d的力學(xué)刺激無論是作用于BMSCs還是BMSCs/PRF雙膜復(fù)合體后,BMP2、BMP受體(BMPRⅠB、BMPR2)以及Smad1、Smad5的基因及蛋白水平均上調(diào);而無壓力刺激時,BMSCs/PRF雙膜復(fù)合體常規(guī)培養(yǎng)4d后,BMPs相關(guān)分子表達無明顯上調(diào)。提示,在適當?shù)纳锪W(xué)作用下,BMPs信號相關(guān)分子可以感應(yīng)到力學(xué)信號的刺

10、激,而將信號傳遞至胞內(nèi)發(fā)揮其相應(yīng)的作用,BMPs信號通路參與了壓力促BMSCs/PRF雙膜復(fù)合體成軟骨響應(yīng)過程。
　　第三部分:為了探索在單次加載過程中,BMPs信號分子激活的時效性,對BMSCs和BMSCs/PRF雙膜復(fù)合體給予120KPa持續(xù)加載120min,無壓力刺激時,BMSCs/PRF雙膜復(fù)合體和BMSCs膜片在常規(guī)培養(yǎng)液中培養(yǎng)120min,分別在0、30、60、90、120min五個時間點,通過Real-time PC

11、R和Western Blot檢測BMPs相關(guān)分子基因和蛋白的表達。結(jié)果顯示:無論是BMSCs還是BMSCs/PRF雙膜復(fù)合體,在120min持續(xù)壓力加載過程中,60min時BMP2及BMPs信號通路相關(guān)分子基因和蛋白的表達均最佳,無壓力刺激時,BMSCs/PRF雙膜復(fù)合體常規(guī)培養(yǎng),不同時間點檢測BMPs信號通路相關(guān)分子表達均無明顯差異。提示:在120min的持續(xù)加載過程中,60min時BMPs信號通路相關(guān)分子表達最佳,從分子角度證明了實

12、驗前期篩選的持續(xù)性加載1h時長的可行性,并且進一步說明BMPs信號是壓力調(diào)控BMSCs/PRF雙膜復(fù)合體產(chǎn)生效應(yīng)的重要分子機制之一,而單純富含復(fù)合生長因子的PRF作用并不能有效激活BMSCs中的BMPs信號通路。
　　通過WesternBlot技術(shù),對BMPs信號在壓力調(diào)控兔BMSCs/PRF雙膜復(fù)合體成軟骨響應(yīng)中的作用進行研究。結(jié)果顯示兔BMSCs/PRF雙膜復(fù)合體在給予單次60min、120KPa持續(xù)壓力加載時,軟骨細胞特有的

13、細胞外基質(zhì)Ⅱ型膠原(Collagen type two,Col-Ⅱ)、蛋白多糖(Aggrecan)的蛋白表達升高;加入外源性BMPs抑制劑Noggin后,相同力學(xué)刺激后Col-II和Aggrecan表達的下調(diào)。提示壓力促進BMSCs/PRF雙膜復(fù)合體成軟骨響應(yīng)中BMPs信號通路有著重要的作用。
　　實驗結(jié)論:在課題組前期證明的促BMSCs/PRF雙膜復(fù)合體成軟骨響應(yīng)的生物力刺激條件(120KPa、1h/d、連續(xù)4d的靜態(tài)液壓加載)

14、作用下,BMSCs/PRF雙膜復(fù)合體中BMPs信號通路相關(guān)分子BMP2、BMP受體(BMPRⅠB、BMPR2)及Smad1、Smad5表達均明顯上調(diào),而無壓力刺激的靜態(tài)BMSCs/PRF雙膜復(fù)合體培養(yǎng)組并未見到BMPs信號通路的激活,說明BMPs信號通路參與了壓力促BMSCs/PRF雙膜復(fù)合體成軟骨過程中的力學(xué)信號傳導(dǎo);進一步分析單次壓力加載中BMPs活化的時間效應(yīng),發(fā)現(xiàn):120min的持續(xù)加載過程中,120KPa持續(xù)60min時BMP