松材線蟲纖維素酶的致病機(jī)理研究.pdf

1、松材線蟲(Bursaphelenchus xylophilus)是松樹的一種災(zāi)難性病害的病原生物，是引起松樹萎蔫病的主要原因，但其致病機(jī)理目前說法不一，主要集中于毒素學(xué)說、空洞化學(xué)說和酶學(xué)學(xué)說等三種不同觀點(diǎn)，并且大多數(shù)結(jié)論都是建立在疫木形態(tài)學(xué)變化的基礎(chǔ)上，未能在分子水平上闡明其內(nèi)在機(jī)理。近年來松材線蟲纖維素酶的研究一直是松材線蟲病病理學(xué)研究的一個(gè)熱點(diǎn)，并取得了一定的進(jìn)展。本研究為了在蛋白質(zhì)水平和分子水平上闡明該病的部分致病機(jī)理，分別從不

2、同角度對(duì)松材線蟲纖維素酶進(jìn)行了研究。 本研究首先通過形態(tài)學(xué)觀察、同工酶分析、ITS-RFLP以及RAPD分析等方法分別對(duì)來自于不同國家和地區(qū)的40株線蟲進(jìn)行鑒定。結(jié)果表明，通過尾尖突的有無或形狀的不同，可以初步區(qū)分松材線蟲和擬松材線蟲；利用谷草轉(zhuǎn)氨酶的同工酶分析可以準(zhǔn)確地區(qū)分上述兩種線蟲；基于分子生物學(xué)的ITS-RFLP分析除了可以準(zhǔn)確地鑒定兩種線蟲外，還可以對(duì)擬松材線蟲的地域特征作出判斷，劃分為亞洲型和歐洲型；而RAPD分析不

3、僅能區(qū)分兩種線蟲，還可以描述各種松材線蟲和擬松材線蟲種內(nèi)以及種間的遺傳進(jìn)化關(guān)系。借助RAPD分析結(jié)果，我們確定了具有代表性的安徽滁州馬尾松(P.massiniana)(No.10)和美國木制包裝中的松材線蟲(No.12、No.13)以及四川鄰水華山松(P.armandii)中的擬松材線蟲(No.16)作為后續(xù)的研究的材料。 為了闡明松材線蟲分泌的纖維素酶在松樹疫木的病理學(xué)研究上的重要地位，本研究通過丙酮沉淀、離子交換層析和凝膠過

4、濾等方法對(duì)松材線蟲纖維素酶進(jìn)行初步純化，得到了分子量分別為58.9kD和29.8kD的兩種纖維素酶(BXC60和BXC30)。其中BXC60具有良好的抗原性，其水解羧甲基纖維素鈉(CMC)的比活力為100.27U/mg，與純化前的粗酶液的比活力相比提高了10.4倍，纖維素酶活力的回收率為23.9％。以纖維素酶BXC60為指標(biāo)，利用抗松材線蟲總蛋白抗體(Anti-BX)，本研究建立了一種選擇性抗體酶聯(lián)免疫分析法(SAEIA)，并顯示了較好

5、的特異性。利用該方法可以檢測(cè)出疫木中存在的纖維素酶，其檢測(cè)靈敏度為0.1μg/well，為松材線蟲的研究提供一種簡(jiǎn)便、快捷地的手段。 以純化的BXC60為抗原制備了高效價(jià)抗BXC60血清(Anti-BXC60)，同時(shí)提取免疫小鼠的脾細(xì)胞總RNA，通過抗體工程的方法，構(gòu)建了庫容量約為5×10<'4>的單鏈抗體庫。以BXC60為靶標(biāo)進(jìn)行篩選，獲得scFv基因，并通過基因工程的手段，進(jìn)一步將scFv與EGFP進(jìn)行融合表達(dá)，獲得了既具有

6、綠色熒光的特性，同時(shí)具有與BXC60特異性反應(yīng)功能的雙功能融合蛋白。利用Anti-BXC60血清進(jìn)行的免疫組化的結(jié)果表明，纖維素酶在線蟲的食道腺處有很強(qiáng)信號(hào)反應(yīng)，并且在吻部有微弱的信號(hào)，說明該酶可能產(chǎn)生于食道腺，并由口針向體外分泌。與此同時(shí)采用scFv-EGFP進(jìn)行松材線蟲活體染色的結(jié)果也顯示，食道腺處可觀測(cè)到明顯的綠色熒光信號(hào)，與上述結(jié)論相吻合。進(jìn)一步利用Anti-BX和Anti-BXC60兩種抗血清，對(duì)松材線蟲分泌物進(jìn)行免疫學(xué)分析，

7、結(jié)果顯示，松材線蟲可以通過分泌孔向體外分泌大量的可溶性蛋白；而纖維素酶的分泌則是通過口針向體外分泌。疫木切片的免疫組化染色結(jié)果顯示，天然感染松材線蟲的疫木樣品中，含有大量的松材線蟲蛋白抗原，其主要集中于縱向管胞細(xì)胞中，而致病性的纖維素酶抗原，則主要分布于管胞、樹脂道和射線細(xì)胞中，表明松材線蟲在感染松樹的入侵初期，主要沿樹脂道、射線及管胞細(xì)胞在樹體內(nèi)作橫向或縱向的移動(dòng)。 此外本研究采用3'RACE和5'RACE并結(jié)合RT-PCR的

8、方法，分別獲得三種不同來源的松材線蟲纖維素酶基因BXC10、BXC12和BXC13。與報(bào)道的同本線蟲的纖維素酶基因Bx-eng-3進(jìn)行比對(duì)分析后發(fā)現(xiàn)，四種纖維素酶基因的同源性為95.83％。其中BXC10與BXC13的同源性為97.17％，基因大小相同，與聚類分析結(jié)果相一致；而BXC12的大小為1038bp，與Br-eng-3相比，分別少21或42個(gè)堿基的部分重復(fù)序列。分別將上述四個(gè)基因轉(zhuǎn)入畢赤酵母進(jìn)行表達(dá)，所表達(dá)的纖維素酶的活力相當(dāng)，

9、說明這種重復(fù)序列的缺失并不影響纖維素酶的活力。進(jìn)一步經(jīng)10L發(fā)酵罐發(fā)酵表達(dá)制備纖維素酶BXC10，發(fā)酵液比活力為7.70U/mg，并可以有效水解松木切片中的纖維素，平均每單位纖維素酶在24h內(nèi)可以產(chǎn)生17±3.5ng還原糖。環(huán)境掃描電鏡和X.射線小角散射的分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，切片表面隨著時(shí)間的延長(zhǎng)變得粗糙，纖維素結(jié)構(gòu)變得稀疏，證明該酶能夠破壞細(xì)胞壁，具有明顯的致病能力，為松樹萎蔫病的重要的致病因子之一。 綜上所述，本研究從松材線蟲的分