PCR-RFLP和MLPA基因診斷脊肌萎縮癥的研究.pdf

1、目的:
　　脊肌萎縮癥(spinalmuscularatrophy，SMA)是一種以脊髓前角退行性變?yōu)樘卣鞯某Ｈ旧w隱性遺傳病，表現(xiàn)為下運動元性、進行性、對稱性肌無力和萎縮，近端重于遠端，下肢重于上肢。人群中發(fā)病率約為1/10000，突變基因攜帶頻率為1/50-1/35[12]。居致死性常染色體隱性遺傳病第二位，僅次于囊性纖維變。目前尚沒有有效的治療方法[3]，因此先證者的基因檢查和群體中攜帶者的篩查工作對于遺傳咨詢、指導(dǎo)生育具有

2、重要的作用。
　　該病的致病基因為運動神經(jīng)元存活基因SMN(survivalmortorneurongene，SMN)，位于5q11.2～13.3。SMN基因有2個拷貝，即SMN1和SMN2。SMN1和SMN2高度同源，二者僅有5個堿基的差別[4]。一般認(rèn)為SMN1為該病的主要致病基因，SMN2屬調(diào)節(jié)基因，與疾病的嚴(yán)重性呈反比。研究認(rèn)為，約95％的SMA患者存在SMN1第7和或第8外顯子的純合缺失和SMN1轉(zhuǎn)變?yōu)镾MN2，而約5％

3、的患者是由基因突變引起的。因此，檢測SMN1基因第7、8外顯子缺失成為診斷該病的主攻方向。
　　本研究分別采用以往應(yīng)用最廣泛的檢測SMN1基因的聚合酶鏈?zhǔn)较拗菩云伍L度多態(tài)性分析(PCR-RFLP)方法和最新的多重連接依賴式探針擴增(MLPA)技術(shù)對30例臨床疑似SMA患兒及其父母進行基因診斷，并對兩種方法進行比較，分析兩種方法對各類SMN基因缺失先證者診斷的一致性，評估MLPA方法對攜帶者檢出的準(zhǔn)確度。
　　方法:

4、　　本研究采用鹽析方法提取所有受試者外周血DNA，DNA的純度和濃度均經(jīng)核酸定量儀(NADODROP2000)測定。常規(guī)PCR-RFLP方法擴增SMN7、8外顯子，用DralⅠ和DdelⅠ酶切PCR產(chǎn)物，2％瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR及酶切產(chǎn)物，凝膠成像系統(tǒng)記錄結(jié)果。同時利用MLPA試劑盒P021方法進行驗證比較，計算SMN拷貝數(shù)，并對病人組、攜帶者組與正常對照組SMN2拷貝數(shù)進行比較，采用SPSS16統(tǒng)計分析。
　　結(jié)果:

5、　　根據(jù)實驗結(jié)果共確診24例為SMA病人，即22例SMN1第7+8號外顯子純合缺失患兒和2例Ex7純合缺失，兩種方法結(jié)果一致。回顧分析臨床表現(xiàn)，發(fā)病年齡，疾病進展等臨床資料，確定Ⅰ型9例，Ⅱ型9例，Ⅲ型6例。其余6例PCR-RFLP方法未見異常家系中經(jīng)MLPA方法分析發(fā)現(xiàn)1例患兒和2例母親為SMN1外顯子7、8雜合缺失攜帶者；MLPA方法還在SMA家系中發(fā)現(xiàn)3例“2+0”型攜帶者。MLPA方法共分析檢出52例攜帶者和18例正常者。結(jié)果發(fā)

6、現(xiàn)SMN2拷貝數(shù)在SMA患者中以4、5為主、攜帶者以2、3為主、正常人以1、2多見，其各拷貝數(shù)的頻率分布在病人組與攜帶者組(x2=30.694)、病人組與正常人組(x2=21.997)中p<0.001，而在攜帶者與正常人組(x2=3.5)p>0.05。
　　結(jié)論:
　　與PCR-RFLP相比，MLPA更加簡單、準(zhǔn)確、高效，僅需要少量的DNA模板就能快速準(zhǔn)確的定量SMN1、SMN2，還有助于區(qū)分表型和篩查攜帶者，是一種高效的遺