PCR-RFLP快速檢測(cè)和鑒定尿液中念珠菌的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：嘗試模擬真菌感染尿液的制備，探索聚合酶鏈反應(yīng)結(jié)合限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析(PCR—RFLP)快速檢測(cè)和鑒定念珠菌的方法。 方法：采用溶細(xì)胞酶(Lyticase)結(jié)合Biospin真菌基因組DNA提取試劑盒提取白色念珠菌、熱帶念珠菌、克柔念珠菌及近平滑念珠菌基因組DNA，同時(shí)與十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)法提取結(jié)果進(jìn)行比較。采用PCR—RFLP技術(shù)，即對(duì)核糖體DNA內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS)的編碼基因進(jìn)行擴(kuò)增后，用MspI

2、酶切PCR產(chǎn)物產(chǎn)生不同的特異帶型，對(duì)50份不同念珠菌的模擬尿液標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)和鑒定，并與常規(guī)培養(yǎng)結(jié)果進(jìn)行比較，同時(shí)檢測(cè)該技術(shù)的敏感性、特異性。 結(jié)果：1．Biospin真菌基因組DNA提取試劑盒提取的DNA含量明顯高于十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)法，差異有顯著性(p＜0.01)。2．真菌通用引物對(duì)模擬尿液中常見(jiàn)的白色念珠菌、熱帶念珠菌、克柔念珠菌及近平滑念珠菌進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果均為陽(yáng)性，在520bp左右均擴(kuò)增出一清晰的條帶。3．應(yīng)

3、用通用引物分別對(duì)模擬白色念珠菌、熱帶念珠菌、克柔念珠菌及近平滑念珠菌感染尿標(biāo)本作PCR，檢測(cè)的敏感度均為10CFU/ml。4．PCR產(chǎn)物酶切后進(jìn)行0．8％聚丙酰胺凝膠垂直電泳，條帶清晰，條帶之間分離明顯，產(chǎn)生了四種不同的特異性帶型，將四種常見(jiàn)念珠菌區(qū)分開(kāi)來(lái)。5．PCR—RFLP對(duì)模擬標(biāo)本檢測(cè)和鑒定結(jié)果明顯高于常規(guī)培養(yǎng)(p＜0.005)，PCR—RFLP法與常規(guī)培養(yǎng)法具有較好的一致性(k=0.789，p＜0.01)。 結(jié)論：PCR