深部念珠菌病快速PCR檢測的標(biāo)準(zhǔn)化研究.pdf

1、中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院博士學(xué)位論文深部念珠菌病快速PCR檢測的標(biāo)準(zhǔn)化研究姓名：符美華申請學(xué)位級別：博士專業(yè)：皮膚病學(xué)與性病學(xué)指導(dǎo)教師：劉維達(dá)20070101深部念珠菌病快速PCR檢測的標(biāo)準(zhǔn)化研究深部念珠菌病常繼發(fā)于嚴(yán)重的基礎(chǔ)病，很容易造成侵襲性感染，死亡率居高不下。對念珠菌的快速檢出和鑒定對臨床早期診斷、指導(dǎo)合理用藥、提高患者生存率均有重要意義，因為大量的臨床病例和教訓(xùn)已表明，如不能進(jìn)行早期診治則真菌感染的預(yù)后不佳。傳統(tǒng)的念珠菌

2、鑒定方法包括糖同化實驗、芽管實驗、CHROMAgar快速顯色等，周期較長(2—3天以上)，且培養(yǎng)的陽性率不高(通常低于50％)“”，非常不利于早期快速診斷和治療(培養(yǎng)加鑒定的時間約需7天)。因此，迫切需要快捷、可靠和方便的診斷方法“4。以PCR方法為基礎(chǔ)的分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展在l臨床微生物檢測領(lǐng)域掀起了一場革命。分子生物學(xué)檢測方法由于操作簡單、可重復(fù)性、具有較高的敏感性和特異性，可以很好地彌補傳統(tǒng)真菌鑒定方法的不足，特別是對于培養(yǎng)周期長

3、、表型易變和鑒定困難而又嚴(yán)重威脅患者生命的真菌有其特別的優(yōu)越性。隨著新技術(shù)的不斷發(fā)展，有越來越多的分子生物學(xué)方法應(yīng)用于念珠菌病的鑒定和診斷，其中涉及到念珠菌的種屬特異性引物的研究、念珠菌感染的分子流行病學(xué)研究、以及對耐藥念珠菌的耐藥基因的研究等方面。常用的分子生物學(xué)方法有通用引物PCR、核酸探針、RFLP、PCRRFLP、PCR—SSCP、DNA指紋等。通用引物PCR具有快速敏感的優(yōu)勢，但特異性差，尤其不能對耐藥菌株進(jìn)行快速檢出和鑒定。

4、核酸探針雖增加了特異性，但需要大量的酶和探針，價格昂貴且耗時，難以用于常規(guī)實驗室檢查。酶聯(lián)免疫吸附實驗可自動化操作，較為方便，可以測真菌特異抗體，也可以測定真菌胞壁抗原，但測定的菌譜很窄，且敏感性和特異性都不理想。PCRRFLP、PCRSSCP、DNA指紋的敏感性和特異性都較好，而且不需要大量的探針和酶，但操作比較復(fù)雜、儀器設(shè)備要求高，多用于實驗室研究，目前均不宜用于臨床診斷e1516J。上述研究包括我們近些年進(jìn)行的一系列研究在我國仍停

5、留在實驗室階段，在國外也僅是初步應(yīng)用于小樣本患者。究其原因，主要在于分子診斷技術(shù)仍未解決臨床檢測需要的標(biāo)準(zhǔn)化問題，也沒有客觀評價其可靠性、敏感性和特異性的系統(tǒng)研究結(jié)果。為客觀評價快速PCR檢測深部念珠菌病的可靠性，敏感性和特異性，建立PCR技術(shù)大規(guī)模應(yīng)用于臨床的標(biāo)準(zhǔn)化方案，本研究欲對模擬的臨床念珠菌感染的標(biāo)本進(jìn)行真菌通用引物的盲法檢測，同時用白念珠菌、克柔念珠菌和光滑念珠菌的種特異性引物進(jìn)行三重PCR檢測并對實驗程序和方法進(jìn)行優(yōu)化，評價