PLC非依賴PKC途徑介導PTH成骨作用的體外研究.pdf

1、背景:隨著社會老齡化的進程，骨質疏松癥的發(fā)病率逐年上升，并嚴重影響著老年人的身體健康。目前，治療骨質疏松癥的藥物以抗骨質吸收為主要作用，而對骨量的增加有限，近期來甲狀旁腺素(PTH)被證實具有可靠的抗骨質疏松作用，可促進皮質骨和松質骨形成、增加骨密度、降低骨折發(fā)生率等，是目前臨床可靠的促進骨合成代謝的藥物。但PTH的療效并不十分理想，主要是因為其對骨組織具有雙向作用，這也與其激活多種信號通路有關。目前認為PTH主要激活三條信號通路:cA

2、MP/PKA、PLC/PKC和nonPLC/PKC通路。既往研究發(fā)現(xiàn)，cAMP/PKA通路是PTH骨作用的主要機制，但有雙向作用，PLC/PKC通路有輔助增強PTH的破骨作用，而nonPLC/PKC通路具有成骨部位特異性。目前，信號通路的研究主要通過檢測蛋白激酶的活化，蛋白激酶活化的檢測方法主要有細胞內(nèi)轉位、絲蘇氨酸殘基的磷酸化及特殊底物磷酸化，這些方法缺乏直接性及靈敏性。而熒光共振能量轉移(FRET)技術近年來被廣泛用于信號通路的研究

3、，具有直接靈敏的特性。Newton等首先報道了檢測PKC活化的FRET系統(tǒng)，在CFP和YFP之間插入了特異性PKC作用底物和FHA2磷酸化肽段的結合域;PKC-delta激活報告分子與其類似，插入了特異性PKC-delta作用底物和FHA2磷酸化肽段的結合域。當轉染了兩種質粒的細胞表達出CKAR分子和PKC-delta報告分子時，在共聚焦顯微鏡下根據(jù)熒光強度的相對改變(C/Y)就可以判斷刺激物是否激活了PKC或PKC-delta。

4、>　　 目的:提取、純化及鑒別目的質粒:CKAR、PKC-delta、PTHR1及DSEL，再通過FRET技術及共聚焦顯微鏡證明PKC或PKC-delta活化的FRET系統(tǒng)可用于信號通路的研究，并探討nonPLC/PKC通路是否有其他途徑的參與，以及它們之間的關系。
　　 方法:運用熱激法轉化大腸桿菌，擴增目的質粒，并通過堿裂解法從大腸桿菌中提取質粒，再通過質粒提取試劑盒純化質粒。通過紫外分光光度計測量其濃度和純度，經(jīng)酶切及凝

5、膠電泳鑒定質粒。
　　 運用脂質體轉染法分別將CKAR或PKC-delta質粒轉染進HEK293細胞體內(nèi)，培養(yǎng)48h后通過共聚焦顯微鏡分析CKAR或PKC-delta質粒是否可在細胞內(nèi)正常表達以及在佛波酯(TPA)的刺激下FRET效率及青色熒光與黃色熒光強度的比值(c/Y)是否改變，判斷它們是否具備檢測PKC或PKC-delta活化的功能。
　　 PTHR1是PTH的野生型受體，與PTH結合后激活三個通路，而DSEL為人

6、工合成的突變型受體，其與PTH結合后不能激活PLC/PKC通路。將PTHR1或DSEL質粒與CKAR質粒共轉染進HEK293細胞，培養(yǎng)72h后通過共聚焦顯微鏡觀察PTH(1-34)是否可引起CKAR分子發(fā)生FRET改變，并與不轉染受體質粒的HEK293細胞作對比，以此判斷PTHR1和DSEL質粒是否可在細胞內(nèi)成功表達以及其所表達的蛋白是否具有功能。
　　 目前認為，PTH(1-34)具備全段PTH的活性，cAMP/PKA、PLC

7、/PKC和nonPLC/PKC三個途徑均可激活;G1R19(1-34)不激活PLC/PKC通路;G1R19(1-28)可激活cAMP/PKA通路，不激活PL/PKC通路，而對nonPLC/PKC通路的激活存在爭議。分別使用這三種不同的甲狀旁腺素信號選擇性類似肽刺激共轉染PTHR1或DSEL質粒和CKAR或PKC-delta質粒的HEK293細胞，培養(yǎng)72h后通過共聚焦顯微鏡觀察FRET的改變，判斷甲狀旁腺素對PKC的激活情況，并從多個角

8、度出發(fā)探索甲狀旁腺素的信號通路。
　　 結果:擴增各質粒，并用質粒提取試劑盒提取及純化目的質粒，用紫外分光光度計測量質粒的純度和濃度，PKC-delta、CKAR、PTHR1和DSEL質粒的A260/A280分別為1.94、1.93、1.93和1.91，濃度分別為431.4、456.3、501.8和522.6ng/μl。經(jīng)不同限制性內(nèi)切酶對四種質粒酶切后，凝膠電泳顯示質粒片段均在相應的理論值范圍。
　　 在培養(yǎng)體系中加入

9、終濃度200nmol/L的TPA后，在表達CKAR和PKC-delta報告分子的HEK293細胞，CFP的發(fā)射光增強，YFP的發(fā)射光減弱，相應的FRET效率下降，青色與黃色熒光強度的比值(C/Y)明顯增大。
　　 在未轉染甲狀旁腺素受體質粒(PTHR1或DSEL)的細胞，10μmol/L的PTH(1-34)未能明顯改變C/Y的值，而在轉染有PTH受體的細胞內(nèi)，100nmol/L的PTH(1-34)即可使C/Y明顯增大。
　

10、　 在轉染CKAR質粒并表達PTHR1或DSEL受體的HEK293細胞，0.1％TFA作為三種肽的溶劑，均未能引起C/Y的改變，100nmol/L的PTH(1-34)、100nmol/L的G1R19(1-34)及1μnol/LG1R19(1-28)均使C/Y明顯增加。在轉染PKC-delta質粒并表達PTHR1或DSEL受體的HEK293細胞，具有同樣的結果，0.1％TFA均未能引起C/Y的改變，100nmol/L的PTH(1-34)

11、、100nmol/L的G1R19(1-34)及1μmol/LG1R19(1-28)均使C/Y明顯增加。在轉染CKAR或PKC-delta質粒的HEK293細胞，100μmol/L的8Br-cAMP未引起C/Y的改變。
　　 結論:1.CKAR和PKC-delta質?？梢栽诨罴毎麅?nèi)成功表達并且具備檢測PKC或PKC-delta活化的功能，提示該方法是一種靈敏可靠的PKC活性檢測模型。2.PTH可通過PLC非依賴途徑激活PKC，而c