正向遺傳學(xué)方法研究DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶1在斑馬魚(yú)定向造血過(guò)程中的生物學(xué)意義.pdf

1、造血干細(xì)胞具有自我更新能力，并且可以向下游分化形成各種前體細(xì)胞和成熟血細(xì)胞。造血干細(xì)胞異常增殖和分化都可以導(dǎo)致嚴(yán)重的血液疾病。目前的研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了部分與造血干細(xì)胞自我更新以及分化相關(guān)的基因，如bmi1，hoxB4，wnt，pten，hedghog等，但是對(duì)整個(gè)分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的認(rèn)識(shí)還十分局限。斑馬魚(yú)的造血調(diào)控網(wǎng)絡(luò)與人類(lèi)高度保守，因此，我們運(yùn)用斑馬魚(yú)為模式生物篩選更多新的與造血干細(xì)胞自我更新及分化相關(guān)的基因。
　　我們運(yùn)用N-乙基-N-

2、亞硝基脲(ENU)為化學(xué)誘變劑處理雄性斑馬魚(yú)，保種獲得了近1000家攜帶有突變基因的斑馬魚(yú)家系。通過(guò)運(yùn)用標(biāo)記定向造血干細(xì)胞的分子標(biāo)記cmyb來(lái)篩選具有造血干細(xì)胞異常的突變家系，最終獲得了200多個(gè)突變家系。
　　通過(guò)經(jīng)典的三代遺傳學(xué)篩選，本課題最終選定了Idd794突變家系進(jìn)行定位克隆，進(jìn)一步闡述導(dǎo)致Idd794造血干細(xì)胞異常的分子機(jī)制。
　　通過(guò)定位克隆，我們發(fā)現(xiàn)Idd794造血干細(xì)胞異常是由于DNA甲基轉(zhuǎn)移酶1(Dnmt

3、1)中的點(diǎn)突變導(dǎo)致蛋白翻譯的提前終止。截?cái)嗟腄nmt1缺失了DNA甲基化催化結(jié)構(gòu)域，失去了甲基轉(zhuǎn)移酶活性。Dnmt1可以通過(guò)對(duì)新復(fù)制的DNA加上甲基基團(tuán)來(lái)調(diào)控基因的表達(dá)，但是其對(duì)造血調(diào)控的分子機(jī)制并不清楚。
　　在dnmt1突變的胚胎中，定向造血干細(xì)胞的分子標(biāo)記cmyb從受精后36小時(shí)(36hpf)開(kāi)始就開(kāi)始減少，到5dpf時(shí)完全缺失。全胚胎dUTP缺口標(biāo)記(TUNEL)及造血干細(xì)胞的雙標(biāo)實(shí)驗(yàn)顯示細(xì)胞沒(méi)有發(fā)生異常的凋亡。通過(guò)磷酸化

4、組蛋白3(PH3)的免疫熒光標(biāo)記實(shí)驗(yàn)，我們發(fā)現(xiàn)dnmt1突變胚胎中造血干細(xì)胞的增殖能力顯著減弱。進(jìn)一步的分子機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)增殖能力減弱是由cebpa基因表達(dá)上調(diào)所引起的，同時(shí)發(fā)現(xiàn)cebpa基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域DNA甲基化水平明顯降低。過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)錄抑制形式的融合蛋白SUMO2-C/ebpa可以恢復(fù)造血干細(xì)胞減少的表型。同時(shí)，在dnmt1及cebpa雙突變的胚胎中造血干細(xì)胞數(shù)量仍可維持正常，說(shuō)明cebpa是Dnmt1對(duì)造血干細(xì)胞調(diào)控所必需的一個(gè)基