選擇性脾酪氨酸激酶抑制劑P505-15與類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的相關(guān)性研究.pdf

1、背景：
　　類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種以對稱性、多關(guān)節(jié)炎為主要臨床表現(xiàn)的慢性、進(jìn)行性、系統(tǒng)性、自身免疫性疾病，全身多發(fā)關(guān)節(jié)受累。RA是一種復(fù)雜的退行性疾病，其發(fā)病過程中涉及到大量炎性和非炎性細(xì)胞。RA可反復(fù)遷延多年，關(guān)節(jié)內(nèi)滑膜組織過度增殖，形成血管翳，對關(guān)節(jié)軟骨、骨以及韌帶的造成漸進(jìn)性侵襲性破壞，最終將導(dǎo)致關(guān)節(jié)強(qiáng)直、畸形及關(guān)節(jié)功能喪失，致重度殘疾，對人類健康的危害極大?；趯A的發(fā)病機(jī)

2、制以及相關(guān)的細(xì)胞和分子的病理生理研究發(fā)現(xiàn)，脾酪氨酸激酶(Spleen tyrosine kinase，Syk)在RA的發(fā)病機(jī)制中起著關(guān)鍵性的作用。Syk是一個下游信號傳導(dǎo)因子級聯(lián)反應(yīng)激活的主要調(diào)節(jié)酶，在自身抗體的產(chǎn)生過程中，以及在多種內(nèi)在免疫效應(yīng)因子的作用中，具有無可替代的中心作用。免疫細(xì)胞在RA的發(fā)病過程中，也發(fā)揮至關(guān)重要的作用，而Syk也是這些免疫細(xì)胞活化的中心環(huán)節(jié)，在這些細(xì)胞的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中發(fā)揮重要作用。Syk在RA發(fā)病及病情進(jìn)展

3、中發(fā)揮著諸多重要作用，這使得Syk抑制劑成為RA治療的非常有前景的候選藥物。眾多制藥和生物技術(shù)公司對抑制劑表現(xiàn)出了濃厚的興趣。目前針對RA治療和其他一些適應(yīng)癥的許多Syk小分子抑制劑正處在不同研發(fā)階段。p505-15是一種新型的、高度選擇性Syk抑制劑，相對于其它一些小分子Syk抑制劑，p505-15還沒有被系統(tǒng)的深入研究過。
　　目的：
　　通過分子生物學(xué)、細(xì)胞學(xué)及動物實(shí)驗(yàn)、體內(nèi)/體外實(shí)驗(yàn)等多個方面，系統(tǒng)的探討p505-1

4、5對Syk抑制作用的高效性、高特異性，對CIA發(fā)病及病情發(fā)展的有效抑制。
　　方法：
　　通過SUDHL4細(xì)胞株，利用蛋白印跡分析法檢測BCR介導(dǎo)的BLNK的磷酸化，測定Syk的活性;檢測BCR介導(dǎo)的Syk的磷酸化，測定Lyn的活性;驗(yàn)證p505-15抑制Syk的特異性。人的全血在抗-BCR或PMA刺激后誘導(dǎo)SYK依賴的或非依賴的信號系統(tǒng)和B細(xì)胞的功能性活化，使用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞活化程度驗(yàn)證p505-15特異性抑制Syk依

5、賴的白細(xì)胞信號系統(tǒng)的轉(zhuǎn)導(dǎo)和B細(xì)胞的激活。將口服p505-15給藥后的小鼠血液通過磷酸化流式細(xì)胞儀測量Syk活性驗(yàn)證p505-15在體內(nèi)抑制Syk的高效性及可逆性。建立小鼠CIA模型，通過CIA小鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)評分、后踝關(guān)節(jié)腫脹程度以及CIA小鼠關(guān)節(jié)組織HE染色切片觀察關(guān)節(jié)形態(tài)學(xué)變化、番紅O關(guān)節(jié)軟骨染色、關(guān)節(jié)滑膜組織巨噬細(xì)胞浸潤，并使用免疫組化方法測定血清抗-CII IgG1和IgG2a及血清TNF-α、IL-6和IL-17水平等方法驗(yàn)證p

6、505-15抑制CIA小鼠關(guān)節(jié)炎的發(fā)病、發(fā)展及相關(guān)炎性因子的產(chǎn)生。通過獲取分離培養(yǎng)的原代人RA滑膜細(xì)胞，檢測其分泌TNF-α，IL-6和IL-17的水平，驗(yàn)證p505-15可抑制人RA促炎性反應(yīng)從而削弱自身免疫性關(guān)節(jié)炎的發(fā)病。
　　結(jié)果：
　　1、在SUDHL4細(xì)胞株，各不同濃度的p505-15均抑制了BLNK Tyr84的磷酸化，提示Syk活性得到抑制，并顯示了明顯的濃度依賴性;而Lyn活性在試驗(yàn)中的各種p505-15濃度

7、下均沒有觀察到相應(yīng)的抑制。Syk半數(shù)最大抑制所需要的p505-15濃度在0.16-0.4uM之間。
　　2、在人的全血中，p505-15抑制了Syk信號系統(tǒng)介導(dǎo)的ERK Tyr204的磷酸化(pERK Tyr204;均值IC50±SEM，0.27um±0.02)和白細(xì)胞的激活(CD69;均值IC50±SEM，0.28um±0.03)，但沒有抑制Lyn依賴的信號系統(tǒng)介導(dǎo)的Syk Y352的磷酸化(pSyk Y352)。
　　3

8、、小鼠予以p505-1515mg/kg bid的口服劑量后，給藥2小時至6小時期間觀察到Syk的活性被抑制超過50％，其中在服藥后3小時Syk的活性抑制最大，為80％左右;6小時以后Syk活性逐漸恢復(fù)，至24小時Syk活性恢復(fù)至80％以上。在整個實(shí)驗(yàn)過程中沒有觀察到Lyn活性抑制。
　　4、成功獲取小鼠CIA模型，小鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)評分在第28-30天時急劇升高，之后趨于平緩，于實(shí)驗(yàn)的第36天基本達(dá)到頂峰，AI最高計分為9.2±0.7

9、。CIA小鼠后踝關(guān)節(jié)最腫脹處厚度均隨時間延長而增加，至第32天時趨于平緩，于初次免疫后第36天達(dá)到頂峰，最高值為42±2％?？诜505-15的小鼠較口服賦形劑的空白對照組小鼠的足爪紅腫程度明顯減輕，關(guān)節(jié)炎指數(shù)明顯降低。足爪腫脹最大減輕20％，AI值最大降低3.4，統(tǒng)計學(xué)顯示P＜0.01。
　　5、HE染色顯示口服賦形劑的空白對照組CIA小鼠的關(guān)節(jié)有明顯的慢性滑膜炎，關(guān)節(jié)及滑膜層增生，滑膜翳形成，關(guān)節(jié)內(nèi)中性粒細(xì)胞浸潤和纖維蛋白形成

10、，周圍基質(zhì)中的原始中性粒細(xì)胞浸潤;在口服p505-15的治療組CIA小鼠的關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)基本完好，炎性細(xì)胞浸潤和骨侵蝕明顯被抑制。HE染色骨侵蝕組織學(xué)評分顯示口服賦形劑的空白對照組CIA小鼠評分為2.9±0.4，口服p505-15的治療組CIA小鼠評分為1±0.1，統(tǒng)計學(xué)顯示P＜0.01，表明具有顯著性差異。
　　6、番紅O染色顯示口服賦形劑的空白對照CIA小鼠的關(guān)節(jié)表現(xiàn)出明顯的軟骨破壞，關(guān)節(jié)內(nèi)的透明軟骨表面不規(guī)則，提示軟骨缺失，軟骨潮

11、線的缺失和軟骨細(xì)胞固縮;而在口服p505-15治療組的CIA小鼠這一現(xiàn)象明顯減輕，相當(dāng)于正常透明軟骨的各級透明軟骨顯示清晰。關(guān)節(jié)軟骨侵蝕組織學(xué)評分顯示，口服賦形劑的空白對照CIA小鼠評分為2.7±0.2，口服p505-15治療組的CIA小鼠評分為1.3±0.1，P＜0.01表明具有顯著性差異。
　　7、免疫組化分析滑膜組織切片中CD68的表達(dá)檢測滑液的巨噬細(xì)胞浸潤顯示在口服p505-15的治療組CIA小鼠的切片CD68表達(dá)較賦形劑

12、的空白對照組CIA小鼠明顯降低。CD68評分分別為0.8±0.1和3.1±0.3，P＜0.01，表明具有顯著性差異。
　　8、免疫組化方法測定血清抗-CII IgG1和IgG2a，結(jié)果顯示與口服賦形劑的空白對照組CIA小鼠相比較，口服p505-15的治療組CIA小鼠所有的抗-CII抗體皆有顯著的降低，統(tǒng)計學(xué)顯示p＜0.01，表明具有顯著性差異。
　　9、使用免疫組化方法予以測定血清TNF-α、IL-6和IL-17水平顯示口服

13、p505-15小鼠的三種炎性因子水平有顯著下降，統(tǒng)計學(xué)顯示p＜0.01，表明具有顯著性差異。
　　10、獲取分離培養(yǎng)的原代人RA滑膜細(xì)胞，使用20ng/mlIL-1β處理后取上清液行TNF-α，IL-6和IL-17測定。數(shù)據(jù)顯示p505-15處理顯著的降低了TNF-α，IL-6和IL-17水平，提示p505-15抑制促炎性反應(yīng)。
　　結(jié)論：
　　Syk是許多免疫系統(tǒng)的疾病的重要的治療靶點(diǎn)。p505-15是高度特異性的和