線粒體轉錄因子A基因多態(tài)性在高原肺水腫發(fā)生中的作用及機制的初步研究.pdf

1、目的：平原人進入高原后，機體會發(fā)生一系列的代償適應性變化，以適應高原環(huán)境，這個過程稱為習服，若習服不良則可能發(fā)生高原病，例如高原肺水腫(high altitude pulmonary edema, HAPE)。線粒體是機體能量代謝的中心，在低氧細胞損傷和組織、細胞對低氧環(huán)境的習服過程中有非常重要的作用。我室以往的研究結果提示，線粒體功能改變是細胞低氧習服-適應的關鍵環(huán)節(jié)。反之，線粒體結構損傷和功能障礙，則可能是引起機體對于高原低氧環(huán)境習

2、服不良，甚至發(fā)生高原病(如HAPE)的重要因素。HAPE的發(fā)生機制尚不清楚，目前認為與肺血管收縮，肺動脈壓過度升高、肺毛細血管通透性增加、肺泡II型上皮細胞水清除障礙等因素有關。近來研究表明，缺氧時線粒體功能障礙，活性氧(reactive oxygen species, ROS)過度生成，在缺氧引起的肺血管平滑肌細胞收縮、肺水清除障礙的發(fā)生中起重要作用，缺氧線粒體功能障礙可通過多種途徑參與HAPE的發(fā)生。綜上所述，我們推測，HAPE的發(fā)

3、生可能與線粒體DNA（mitochondrial DNA， mtDNA）穩(wěn)定性降低，線粒體功能障礙有關，而線粒體轉錄因子A（mitochondrial transcription factor A,TFAM）作為mtDNA穩(wěn)定性的重要調控因子，其基因多態(tài)性與HAPE發(fā)生易感性之間的關系有待深入研究。
　　方法：在西藏日喀則地區(qū)(海拔3836 m)收集漢族HAPE患者和高原健康對照外周血標本各60例。HAPE患者納入標準根據(jù)1995

4、年中華醫(yī)學會公布的高原肺水腫診斷標準，高原健康對照選取同期進入日喀則地區(qū)的健康漢族人。所有受試者均排除已知的肺臟疾病、心血管疾病以及線粒體相關疾病等。采用全血基因組 DNA提取試劑盒提取基因組DNA，采用超螺旋敏感的qPCR方法檢測HAPE患者mtDNA穩(wěn)定性；采用普通PCR擴增試劑盒，擴增TFAM基因7個外顯子及其相鄰非編碼區(qū)序列并測序，經(jīng)與NCBI基因組數(shù)據(jù)庫網(wǎng)站獲取的人類TFAM基因序列(TFAM transcription fa

5、ctor A, mitochondrial[Homo samiens(human)], Gene ID:7019, updated on27-Mar-2014)比對，獲得單核苷酸多態(tài)性位點(single nucleotide polymorphism, SNP)并進行基因分型，采用卡方檢驗分析比較SNPs位點在HAPE患者和高原健康對照之間的等位基因和基因型頻率分布，采用Binary logistic分析比較各基因型的發(fā)病風險，采用Ma

6、tch軟件(http://www.gene-regulation.com/pub/programs.html＃match)，在線分析TFAM基因全序列轉錄因子結合位點；采用單因素方差分析或雙因素方差分析，比較TFAM SNPs位點基因型對mtDNA損傷的影響，并評價其在HAPE發(fā)生中的作用。
　　結果：⑴HAPE患者原始模板細胞色素b(cytochrome b, cytb)基因拷貝數(shù)(1.590±0.092)顯著高于高原健康對照(

7、1.245±0.076)(p=0.005)，HAPE患者加熱模板cyt b基因拷貝數(shù)(0.865±0.045)顯著低于高原健康對照(1.079±0.057)(p=0.004)；HAPE患者加熱模板 COXIII基因拷貝數(shù)(1.159±0.061)與高原健康對照(1.044±0.039)比較無顯著差異(p=0.115)，但其原始模板細胞色素 c氧化酶亞基(cytochrome c oxidase subunit, coxⅢ)基因拷貝數(shù)(1

8、.354±0.069)顯著高于高原健康對照(1.170±0.069)(p=0.049)。HAPE患者(1.291±0.154)與高原健康對照(1.167±0.094)4977bp片段缺失發(fā)生率無顯著性差異(P=0.494)。⑵在高原健康對照和HAPE患者TFAM的7個外顯子序列和部分相鄰非編碼區(qū)序列發(fā)現(xiàn)了4個SNP位點：A281T、C305T、rs1937、A3790G。其中rs1937多態(tài)性位點已有文獻報導，而A281T、C305T、

9、A3790G多態(tài)性位點為本研究首次發(fā)現(xiàn)。經(jīng)轉錄因子結合位點分析發(fā)現(xiàn)，A281T位點位于轉錄因子Staf結合序列內，可能參與TFAM轉錄調節(jié)。⑶HAPE患者TFAM A281T多態(tài)性位點T等位基因(0％)和AT基因型頻率(0%)顯著低于高原健康對照(15%，30%)(p=0.000，p=0.000)，以A等位基因為參照，T等位基因對于HAPE發(fā)病具有保護作用(OR=0.850，CI：0.788-0.916)，以AA基因型為參照，AT基因型

10、是HAPE發(fā)生的保護性因素(OR=0.800，CI：0.705-0.908)。C305T、rs1937、A3790G位點的基因多態(tài)性與HAPE發(fā)生的易感性無顯著性相關(p>0.05)。⑷通過擴增mtDNA編碼基因cytb反映mtDNA拷貝數(shù)，結果發(fā)現(xiàn)高原健康對照(1.355±0.102)和HAPE患者(1.590±0.092)281AA基因型的原始模板mtDNA拷貝數(shù)顯著高于281AT基因型(0.990±0.061)(p=0.048，p

11、=0.001)，且高原健康對照281AA基因型(1.061±0.065)和281AT基因型(1.118±0.117)加熱模板mtDNA拷貝數(shù)均顯著高于 HAPE患者281AA基因型(p=0.015，p=0.019)。通過擴增 mtDNA編碼基因COX III反映mtDNA拷貝數(shù)，結果發(fā)現(xiàn)高原健康對照(1.281±0.079)和HAPE患者(1.354±0.069)281AA基因型的mtDNA原始模板mtDNA拷貝數(shù)顯著高于高原健康對照2

12、81AT基因型(0.912±0.058)(p=0.009，p=0.001)，各組間加熱模板 mtDNA拷貝數(shù)相差不顯著(F=1.363，p=0.260)。C305T、rs1937、A3790G位點的基因多態(tài)性對mtDNA穩(wěn)定性無顯著性影響(p>0.05)。
　　結論：①mtDNA穩(wěn)定性降低是HAPE發(fā)生的一個重要因素；②報導了TFAM A281T、C305T、A3790G SNPs位點；③TFAM A281T多態(tài)性位點的T等位基因