大腸埃希菌micC啟動子相關性研究.pdf

1、目的：
　　micC是一種編碼小分子非編碼RAN(small non-coding RNA,sRNA)的基因，存在于多種革蘭陰性細菌基因組內(nèi)。micC位于E.coli基因組ompN與ybdK基因之間，其中ompN與ybdK轉(zhuǎn)錄方向一致，而與micC轉(zhuǎn)錄方向相反。micC啟動子位于ompN與micC基因間，長度為227個堿基對（base pair,bp）。該啟動子是否具有雙向轉(zhuǎn)錄活性還未知曉，micC的應激性表達仍有待進一步探索。本

2、文對micC啟動子的雙向轉(zhuǎn)錄活性、micC應激性表達進行了研究。
　　方法：
　　（1）本研究以大腸埃希菌DH5為實驗菌株，用天根生物科技公司產(chǎn)的試劑盒提取其基因組，以其為模板，設計引物分別擴增micC基因227bp、485bp的5＇側(cè)翼序列，并分別正向、反向連接到質(zhì)粒pJRS462表達β-葡萄糖苷酸酶（be ta-gluc uro nidase，gus）報告基因的上游構(gòu)建報告載體，檢測攜帶各報告載體菌株的GUS活性。

3、>　　（2）在實驗（1）正反向啟動子都有活性的情況下，利用Red重組系統(tǒng)將各啟動子連同gus報告基因和卡那霉素抗性基因重組到DH5ɑ基因組上，對啟動子特性進行驗證。
　?。?）檢測各重組菌在各種應激條件下的GUS活性，如溫度、酸堿度、滲透壓、抗生素、氧化應激刺激等。
　　結(jié)果：
　?。?）250bp和500bp的DNA片段正向、反向插入到質(zhì)粒gus報告基因上游后，均檢測出gus基因表達，實驗組GUS活性是陰性對照組的兩

4、倍以上。
　?。?）啟動子連同gus基因和篩選標記成功重組到DH5ɑ基因組上；重組菌進入穩(wěn)定生長期后GUS活性大幅度提高。
　?。?）在不同應激環(huán)境下，各重組菌gus基因表達水平不盡相同：GUS活性隨著溫度升高而升高，隨著溫度的降低而降低；GUS活性隨著滲透壓的增高而降低；氧化應激條件下，正向啟動子誘導的GUS活性表達升高，而反向啟動子GUS活性無顯著變化；在pH應激下，GUS活性無明顯改變。
　　結(jié)論：
　　1

5、.介于micC與ompN基因間的DNA序列為一個雙向啟動子。
　　2.同一長度的啟動子其正、反向間的轉(zhuǎn)錄活性沒有差異。
　　3.細菌進入穩(wěn)定期后micC啟動子表達大幅度提高。
　　4. micC啟動子主要受溫度和滲透壓刺激的調(diào)節(jié)：在溫度升高時，正反向啟動子表達都增高，反之都降低；正反向啟動子在高滲下表達都降低。
　　5.氧化應激促進正向啟動子表達，而對反向啟動子表達沒有影響。
　　6. micC啟動子對pH