量子點作為熒光探針在PCR體系中的應(yīng)用研究.pdf

1、目的：
　　量子點由于其獨特的熒光性質(zhì)而受到很多重視。與傳統(tǒng)的有機熒光染料相比，量子點具有熒光量子產(chǎn)率高，熒光波長可調(diào)，峰型窄而對稱，抗漂白能力強等優(yōu)點?；谶@些優(yōu)點，量子點在生物組織和細(xì)胞成像、熒光分析中具有重要應(yīng)用。其中一個潛在的應(yīng)用就是在PCR中把量子點作為熒光探針來分析DNA的擴增情況。之前已有研究報道過納米粒子對PCR中DNA擴增的影響，例如納米金和巰基乙酸(MAA)修飾的量子點。這些研究指出在適當(dāng)?shù)臐舛认拢{米粒子的加

2、入可以增加PCR擴增的特異性和產(chǎn)率。然而，納米粒子的濃度對這些結(jié)果有重要影響。在較高的濃度下(例如MAA-CdSe大于40 nM)，PCR的擴增會被抑制，產(chǎn)率很低。一般來說，一個PCR過程開始需要95℃下5分鐘的熱變性，然后是95℃變性，60℃退火和72℃延伸的30-40個熱循環(huán)，最后是72℃的5-10分鐘的延伸階段。這樣高溫的反應(yīng)條件對量子點的穩(wěn)定性勢必會造成影響。然而上述這些報道卻沒有一個對納米粒子在PCR熱循環(huán)的耐受性做系統(tǒng)地研究

3、。最近有一項研究報道了采用辛胺修飾的聚丙烯酸(OPA)包裹的量子點連接DNA引物進行PCR擴增，并得到了一對一的量子點標(biāo)記的長片段DNA探針。然而在PCR后量子點的熒光強度卻有了明顯的損失（約30％），這可能是由于OPA的分子量較低，而不能更穩(wěn)定地包裹量子點的緣故。因此抑制PCR擴增和熱循環(huán)的不穩(wěn)定限制了量子點作為熒光探針在PCR領(lǐng)域中的應(yīng)用。
　　在本研究中，我們探索了量子點在PCR和熒光定量PCR反應(yīng)系統(tǒng)中應(yīng)用的可行性。我們合

4、成了有機相CdSe/ZnS量子點，并采用高分子量的兩親性聚合物(OPBEM)來包裹有機相合成的CdSe/ZnS量子點，并且選擇甲氧基PEG(mPEG)來保護量子點的表面，以此來增加量子點在PCR熱循環(huán)中的耐受性。測試結(jié)果表明，這樣修飾的量子點能夠在PCR的各種組分中（尤其是Mg離子）耐受40個熱循環(huán)而幾乎不損失熒光強度。在量子點與PCR擴增反應(yīng)的研究中我們發(fā)現(xiàn)量子點與Ex PCR的相容性好明顯好于PCR。在Ex PCR中增加Ex Taq

5、聚合酶的濃度可以明顯緩解量子點對DNA擴增的抑制。在Real-Time PCR中這種量子點也能夠提供穩(wěn)定可測的熒光。這些探索性的工作為量子點將來在PCR中的應(yīng)用展示了良好的開端。最后我們又測試了以量子點為熒光供體的分子信標(biāo)對目的DNA的檢測效果。這一應(yīng)用也同樣證明了量子點在PCR體系中作為熒光探針檢測DNA的可行性。隨著量子點的表面修飾技術(shù)、連接技術(shù)和熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)的發(fā)展，量子點可以應(yīng)用在PCR領(lǐng)域中作為熒光探針進行定量分析。

6、r>　　方法：
　　1.量子點的合成與表征
　　采用有機相量子點合成方法，成功合成了CdSe/ZnS量子點。紫外光譜，熒光光譜，透射電子顯微鏡，XPS能譜，XRD分析等手段對合成的量子點進行表征。
　　2.量子點的表面修飾
　　采用小分子巰基羧酸MPA和辛胺修飾的高分子PBEM(OPBEM)分別修飾有機相CdSe/ZnS量子點的表面，成功制備水溶性量子點。采用紫外光譜，熒光光譜，透射電子顯微鏡，DLS分析等手段對

7、合成的水溶性量子點進行表征。
　　3.量子點穩(wěn)定性測試
　　分別對MPA和OPBEM包裹制備的水溶性CdSe/ZnS量子點進行穩(wěn)定性試驗，包括電泳穩(wěn)定性試驗和PCR熱循環(huán)穩(wěn)定性試驗。
　　4.OPBEM包裹的量子點以及其表面連接物在PCR熱循環(huán)中的穩(wěn)定性測試
　　測試了PCR反應(yīng)體系(包括普通PCR，Ex PCR和Real-time PCR)各組分（包括PCR buffer，dNTP，聚合酶，DNA引物和模板）對

8、量子點在熱循環(huán)中的熒光穩(wěn)定性的影響。分別用Tris-base，NH2-mPEG1000和NH2-mPEG2000對量子點表面連接保護，考察這些量子點連接物在熱循環(huán)中的熒光穩(wěn)定性。
　　5.量子點對PCR擴增反應(yīng)的影響測試
　　考察OPBEM包裹的量子點mPEG2000連接物的引入對PCR擴增的影響情況。
　　6.量子點分子信標(biāo)的合成，表征以及對目的DNA的檢測
　　合成了量子點分子信標(biāo)(QDMB)，并對其進行UV

9、光譜和電泳表征。用QDMB對目的DNA進行檢測，測試其熒光反彈倍數(shù)。
　　結(jié)果：
　　1.量子點的合成與表征
　　有機相CdSe/ZnS量子點熒光量子產(chǎn)率為72.74％±10％，TEM照片顯示量子點尺寸不超過5nm。XPS分析證明了量子點中含有Zn，S，Cd，Se元素。
　　2.量子點的表面修飾
　　對有機相CdSe/ZnS量子點進行表面修飾，MPA-CdSe/ZnS熒光量子產(chǎn)率為12.09％±10％，OP

10、BEM包裹的量子點熒光量子產(chǎn)率為34.87％±10％。
　　3.不同表面修飾的量子點的穩(wěn)定性
　　電泳試驗中高分子包裹的量子點不受電泳溶液環(huán)境影響，而MPA修飾的量子點會被淬滅。PCR熱循環(huán)試驗中MPA修飾的量子點發(fā)生淬滅或沉淀，不能保持穩(wěn)定性。OPBEM包裹的量子點能夠更好耐受熱循環(huán)。
　　4.OPBEM包裹的量子點在PCR熱循環(huán)中的穩(wěn)定性
　　采用OPBEM包裹的CdSe/ZnS量子點QD590進行PCR熱循

11、環(huán)穩(wěn)定性試驗。發(fā)現(xiàn)這種量子點本身可以耐受40個熱循環(huán)，但是在與PCR組分一起時卻容易受到Mg離子的影響?？疾炝瞬煌琎D590連接物對Mg離子耐受的情況并發(fā)現(xiàn)QD590-mPEG2000效果最好，連接反應(yīng)的比例為mPEG2000∶QD590=1000∶1。
　　5.量子點對PCR擴增反應(yīng)的影響
　　量子點的引入會抑制PCR擴增反應(yīng)。這種抑制在Ex PCR體系中比在PCR體系中要減弱很多，增加Ex Taq聚合酶的濃度可以明顯緩解

12、這種抑制。在熒光定量PCR的測試中，QD590-mPEG2000有熱循環(huán)的穩(wěn)定，可測的熒光信號和較輕的擴增抑制。
　　6.量子點分子信標(biāo)的檢測效率
　　對兩種量子點分子信標(biāo)QD540MBIBFQ和QD590MBCy5檢測互補目的DNA的效果進行了測試。測試結(jié)果表明在加入相當(dāng)于QDMB摩爾數(shù)100倍的互補目的DNA時，QD540MBIBFQ的熒光強度反彈倍數(shù)為1.4倍，QD590 MBCy5為1.7倍。二者的FRET能量傳遞效

13、率En分別為28.57％和41.18％。
　　結(jié)論：
　　1.量子點的合成與表征
　　本章采用文獻中報道的有機相量子點合成方法，成功合成了CdSe/ZnS量子點。紫外光譜，熒光光譜，透射電子顯微鏡，XPS能譜，XRD分析等手段對所合成的量子點進行了表征。
　　2.量子點的表面修飾
　　采用小分子巰基羧酸MPA和OPBEM分別修飾有機相CdSe/ZnS量子點的表面，成功制備水溶性量子點。采用紫外光譜，熒光光譜

14、，透射電子顯微鏡，DLS分析等手段對所合成的量子點進行了表征。
　　3.不同表面修飾的量子點的穩(wěn)定性
　　電泳試驗結(jié)果表明，高分子包裹的量子點比MPA修飾的量子點更能夠耐受環(huán)境中離子的影響(例如EDTA)。PCR熱循環(huán)試驗表明，高分子OPBEM包裹的量子點比小分子MPA修飾的量子點受熱循環(huán)溫度變化的影響要小。不同熒光波長的OPBEM包裹的量子點有不同的耐受性。
　　4.OPBEM包裹的量子點在PCR熱循環(huán)中的穩(wěn)定性

15、r>　　OPBEM包裹的CdSe/ZnS量子點QD590本身可以耐受40個熱循環(huán)。QD590-mPEG2000可以有效對抗Mg離子的沉淀作用，連接反應(yīng)的比例為mPEG2000∶QD590=1000∶1。
　　5.量子點對PCR擴增反應(yīng)的影響
　　DNA擴增反應(yīng)對QD590-mPEG2000的穩(wěn)定性沒有影響。但是量子點的引入?yún)s抑制了擴增反應(yīng)。這種抑制可能是由于納米粒子對PCR組分的非特異性吸附造成的。這種抑制在Ex PCR體系

16、中比在PCR體系中要減弱很多。增加Ex Taq聚合酶的濃度可以明顯緩解這種抑制。在熒光定量PCR的測試中，QD590-mPEG2000有很好的表現(xiàn):熱循環(huán)的穩(wěn)定，可測的熒光信號和較輕的擴增抑制。這為QD590-mPEG2000在熒光定量PCR的應(yīng)用提供了很好的前景。
　　6.量子點分子信標(biāo)的合成與檢測效率
　　成功合成并表征了兩種量子點分子信標(biāo)QD540MBIBFQ和QD590MBCy5，對其檢測互補目的DNA的效果進行了測