子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞株中ARID1A基因突變及ARID1A與ER、PR、P53 mRNA相關(guān)性研究.pdf

1、目的:子宮內(nèi)膜癌是女性生殖道最常見的惡性腫瘤的，在美國(guó)約占婦科癌癥的一半，在我國(guó)子宮內(nèi)膜癌的發(fā)病率在女性惡性腫瘤中占第四位。近年來國(guó)內(nèi)外研究數(shù)據(jù)顯示子宮內(nèi)膜癌的發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)，但是其發(fā)病病因及發(fā)病機(jī)制至今仍不甚清楚。子宮內(nèi)膜癌分子生物學(xué)發(fā)病機(jī)制研究有助于子宮內(nèi)膜癌病因的探究。ARID1A基因（AT豐富的交互區(qū)域基因）是近年來新發(fā)現(xiàn)的一種抑癌基因，位于1P36號(hào)染色體上。ARID1A編碼BAF250a蛋白，是組成SWI-SNF復(fù)合體

2、的關(guān)鍵區(qū)域。在研究的759種惡性腫瘤有6％的腫瘤中存在ARID1A基因突變，并且ARID1A基因的突變失活與其蛋白的表達(dá)缺失有關(guān)。我們前期的研究表明ARID1AmRNA及BAF250a蛋白在子宮內(nèi)膜癌組織中呈低表達(dá)，而在正常子宮內(nèi)膜組織中呈高表達(dá)，并且與病理分級(jí)呈負(fù)相關(guān)，提示ARID1A表達(dá)缺失可能與子宮內(nèi)膜癌的發(fā)病存在一定相關(guān)性，并且可能與子宮內(nèi)膜癌的病理分級(jí)相關(guān)。我們的前期研究還表明在低分化子宮內(nèi)膜腺癌組織中BAF250a蛋白表達(dá)與

3、ER表達(dá)呈正相關(guān)，子宮內(nèi)膜癌組織中BAF250a蛋白表達(dá)與突變P53蛋白表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。但國(guó)內(nèi)對(duì)于ARID1A基因在子宮內(nèi)膜癌上的突變情況尚無報(bào)道，我們選取3種分化程度不同的子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞株，應(yīng)用直接測(cè)序的方法檢測(cè)ARID1A基因突變情況，以探討子宮內(nèi)膜癌發(fā)生的可能的原因，分析ARID1A基因在子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞株中表達(dá)變化機(jī)制，同時(shí)應(yīng)用RT-PCR方法檢測(cè)高中低3種分化程度不同的子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞株中ARID1A與ER、PR、P53mRNA的表

4、達(dá)情況及ARID1A與ER、PR、P53mRNA的相關(guān)性，為后續(xù)的研究奠定基礎(chǔ)。
　　 方法:
　　 1.細(xì)胞培養(yǎng)。應(yīng)用DMEM/F-12完全培基和Hyclone胎牛血清培養(yǎng)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞株，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞并使細(xì)胞濃度達(dá)到4×105個(gè)/ml。
　　 2.應(yīng)用直接測(cè)序法對(duì)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞株中ARID1A基因突變的研究。應(yīng)用Promega公司基因組DNA純化試劑盒提取子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞株DNA。根據(jù)NCBI查詢獲得AR

5、ID1A基因外顯子區(qū)域DNA序列設(shè)計(jì)合成引物進(jìn)行目的基因的PCR擴(kuò)增，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳確認(rèn)擴(kuò)增效果，送上海生工生物工程有限公司對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序。將所得結(jié)果進(jìn)行分析并同人類基因組計(jì)劃基因比對(duì)，尋找子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞株中有無ARID1A基因突變存在。
　　 3.采用RT-PCR法檢測(cè)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞株ARID1A、ER、PR及P53mRNA的表達(dá)情況。根據(jù)GenBank查詢的ARID1A、ER、PR及P53cDNA序列設(shè)計(jì)合成引物，以β

6、-actin為內(nèi)參進(jìn)行目的基因的RT-PCR擴(kuò)增。經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳確認(rèn)擴(kuò)增效果。應(yīng)用gel-proanalysis3.1軟件進(jìn)行掃描觀察電泳結(jié)果，用目的基因的灰度值與相應(yīng)條件下β-actin得灰度值的比值來表示。
　　 4.應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果:
　　 1.子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞株Ishikawa、HEC-1A和KLE基因組DNA的ARID1A基因經(jīng)PC

7、R后，所得產(chǎn)物電泳后均可出現(xiàn)目的條帶。經(jīng)基因測(cè)序檢測(cè)發(fā)現(xiàn):(1)同義突變有:在高分化子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞株中(Ishikawa)ARID1A基因第3外顯子、堿基1644位發(fā)生G→A轉(zhuǎn)換;在中分化子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞株中(HEC-1A)ARID1A基因第16外顯子、堿基3969位發(fā)生C-→A顛換。(2)錯(cuò)義突變有:在高分化子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞株中(Ishikawa)ARID1A基因第1外顯子、堿基833位發(fā)生G→C顛換，在中分化子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞株中(HEC-

8、1A)ARID1A基因第2外顯子、堿基1212位發(fā)生A→T顛換，第20外顯子、堿基5281位發(fā)生G→T顛換;在低分化子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞株中(KLE)ARID1A基因第1外顯子、堿基833位發(fā)生G→C顛換。(3)無義突變有:在中分化子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞株中(HEC-1A)ARID1A基因第20外顯子、5503位發(fā)生C→T轉(zhuǎn)換;在低分化子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞株中(KLE)ARID1A基因第20外顯子、堿基6343位發(fā)生C→T轉(zhuǎn)換。(4)移碼突變有:在低分化子

9、宮內(nèi)膜癌細(xì)胞株中(KLE)ARID1A基因第7外顯子、堿基2272位發(fā)生堿基C缺失。
　　 2.ARID1A、ER、PRmRNA在高分化子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞株中(Ishikawa)的表達(dá)明顯高于其在中、低子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞株中(HEC-1A、KLE)的表達(dá)(P＜0.05）。P53mRNA在高分化子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞株中(Ishikawa)的表達(dá)明顯低于其在中、低分化子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞株中(HEC-1A、KLE)的表達(dá)(P＜0.05）。
　　

10、 3.在高、中分化子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞株中(Ishikawa、HEC-1A)，ARID1AmRNA的表達(dá)與ER、PRmRNA的表達(dá)無明顯相關(guān)(P＞0.05)。在低分化子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞株中(KLE)，ARID1AmRNA的表達(dá)與ER、PRmRNA的表達(dá)呈正相關(guān)(P＜0.05)。在高、中、低分化子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞株中(Ishikawa、HEC-1A和KLE)，ARID1AmRNA的表達(dá)與P53mRNA的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（P＜0.05）。
　　 結(jié)論

11、:
　　 1.高、中、低分化子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞株中均存在ARIDIA基因突變，無義突變只存在于中、低分化子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞株中，移碼突變只存在于低分化子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞株中。
　　 2.ARID1A、ER、PRmRNA的表達(dá)量隨著3種子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞株分化程度的減低而減低。P53mRNA表達(dá)量隨著3種子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞株分化程度的減低而增加。在低分化子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞株中，ARID1AmRNA的表達(dá)與ER、PRmRNA的表達(dá)呈正相關(guān)。在高、中