貴州省一家族性中樞神經系統(tǒng)血管母細胞瘤的基礎和臨床研究.pdf

1、目的: 分析家族性CNS HB家系的流行病學及臨床特點,闡述診治方法的可行性,探尋發(fā)病機制。
　　方法: （1）對一個家族性CNS HB的38名家族成員進行流行病學調查，體格檢查和影像學篩查。（2）對該家族中7名CNS HB患者的病史、臨床表現(xiàn)、影像學資料及診斷治療方法、隨訪進行描述和分析。（3）應用光鏡、電鏡及免疫組織化學染色對4例進行手術的CNS HB患者的腫瘤組織和6例外傷腦組織(作為對照)進行病理學檢查。（4）抽取該 CN

2、S HB家系共38位成員及30例健康對照者的外周血，提取DNA和RNA，用PCR方法擴增 VHL基因外顯子1及2并進行測序；用Real-time PCR法測定外周血細胞中 VHL mRNA表達水平。(5)對所獲取的CNS HB的腫瘤組織和對照組正常腦組織進行蛋白質提取、酶解，應用Label-free蛋白組學方法進行定量分析，同時對篩選出的差異蛋白進行生物信息分析。
　　結果: （1）該家系成員中現(xiàn)存有7例發(fā)病，年齡14～53歲，平

3、均36.5歲，外顯率10/38(26.3％)，男性發(fā)病比女性多見(6：4)，CNS HB占90%，且多發(fā)性HBs占20%；遺傳可能來自父系(I2成員)。（2）7例患者均未合并其它部位病變，其中6例為實質性腫瘤，2例為囊性腫瘤；5例患者的腫瘤位于小腦半球、延髓和腦干旁，1例位于頸部脊髓，1例位于視網膜；4例患者共進行7次顯微手術，切除血管母細胞瘤10枚，術后隨訪8年；先證者在術后6年異位復發(fā)，未予處理，繼續(xù)隨訪；1例進行激光治療視網膜血管

4、瘤；2例癥狀不明顯進行隨訪在隨訪中未見新發(fā)病灶，原病灶也未增大；復發(fā)率為42.8%（3/7）。（3）病理學特征：HE染色可見腫瘤由豐富的毛細血管和間質細胞構成，胞漿呈空泡狀或泡沫狀，未見異型核的瘤細胞。波形蛋白、血管內皮生長因子受體、α抑制素、烯醇化酶染色在HB間質細胞均呈強陽性表達； CD31、CD34及vimentin在HB內皮細胞均呈強陽性表達；但是膠質纖維酸性蛋白、角蛋白抗原、上皮膜抗原染色在CNS HB表達均呈陰性。Ki-67

5、標記指數(shù)，除1例第二次手術為2％，余均為l％。電鏡觀察：可見內皮細胞呈扁平形，較幼稚，細胞核較大，染色淡，胞漿內可見到Weibel-Palade小體；周細胞位于內皮細胞外側，靠近血管腔，體積較內皮細胞小，核呈卵圓形，細胞漿較少，細胞周圍有一層完整的基底膜包繞。間質細胞呈橢圓形，表面不規(guī)則，細胞核大，染色深，細胞漿中有豐富的脂滴空泡。(4)在此CNS HB家系成員中，7位發(fā)病者在 VHL外顯子1均測出位為5’端非編碼區(qū)第19位核苷酸發(fā)生

6、A→G的突變；與健康對照組相比，VHL基因 mRNA表達水平明顯降低，其中家系成員中已發(fā)病者VHL基因mRNA表達水平(0.062)與未發(fā)病者(0.26)比下降更為明顯。(5)分離鑒定出CNS HB組可信蛋白和肽段分別為385和2195個；正常組可信蛋白和肽段分別是663和3662個。定量分析、差異匹配篩選出差異蛋白只在CNS HB中表達的有3個（vimentin、TPM4及SERPING1）；在HB和對照組織中都表達的13個蛋白質中，

7、有3個蛋白在HB組織中表達上調（HBB、ALB及HBD）、11個蛋白表達下調（如HSP、ATP、PEBP1、FTL、SOD2、PARK7、KRT1 Keratin、Putative等）；只在對照組織中表達的有3個蛋白（Tubulin beta-4 chain、14-3-3及CA1）。在GO功能分析中，參與生物過程（Biological Process，BP）分析提示，生物學過程正負調控、刺激應答、生物粘附、免疫系統(tǒng)過程的功能明顯增強和代

8、謝過程、發(fā)育過程、信號傳遞、細胞進程功能的降低與家族性CNS HB形成有關。在基因分子功能（Molecular Function,MF）分析得出，生物趨化活性功能只在腫瘤組出現(xiàn)；而翻譯調節(jié)活性功能在腫瘤組中缺失；在細胞成分分析（CC）結果顯示在CNS HB組織中細胞外區(qū)、細胞外基質中的蛋白數(shù)量明顯高于對照組；而神經突觸部分和神經元突觸則明顯低于正常對照組。應用COG分析（蛋白相鄰類的聚簇）得出結果是：“核染色質結構和動力學”（B類）與“

9、細胞動力學”（N類）功能只在CNS HB組織中發(fā)現(xiàn)；但是“細胞周期調控”、“細胞分裂”和“染色體分解”（D類）、“輔酶的轉運和新陳代謝”（H類）、“次級代謝生物合成”和“轉運及分解代謝”（Q類），這些功能只在正常對照組中出現(xiàn)，因此我們推測家族性CNS HB的發(fā)生、發(fā)展、易反復復發(fā)可能與B類和N類功能表達上調，D類的失控、H類和Q類的功能異常相關。同時發(fā)現(xiàn)高遷移率族蛋白1、組蛋白H2A、SERPING l、原肌球蛋白α-4、波形蛋白僅在C

10、NS HB中表達，這5個蛋白可能是直接參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程：高遷移率族蛋白1和原肌球蛋白4可能是通過促進細胞遷移、分化和樹突狀細胞的高表達、調節(jié)蛋白酶活性等來促進腫瘤的發(fā)生發(fā)展、浸潤及復發(fā)；H2A高表達和PCBPl的調節(jié)活性的喪失，激活缺氧信號通路，上調HIF-la，促使間質細胞向外分泌EPO及VEGF和α-珠蛋白mRNA的不穩(wěn)定，促進HB的形成。SERPINGl基因在CNS HB中顯著上調可能是促進該腫瘤生長及瘤周水腫的原因之一。

11、PURA所起到的轉錄、翻譯調節(jié)活性在CNS HB中的缺失或失調，導致細胞增殖、生長異常、神經元變性壞死、血管平滑肌和α-肌動蛋白基因的轉錄活性不能被抑制，而參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。
　　結論: （1）.家族性中樞神經系統(tǒng)血管母細胞瘤是嚴重危害患者及其家族成員的一種具有遺傳性的VHL病;發(fā)病年齡較輕，多發(fā)病灶，易復發(fā)，對于每個懷疑有家族史的CNS HB患者都要對其家系成員進行普查，包括影像學、基因生物學及蛋白組學檢測。（2）.家族性中

12、樞神經系統(tǒng)血管母細胞瘤即VHL病的正確診斷需要結合家族史、臨床表現(xiàn)、MRI檢查和病理學檢測以及 VHL基因檢測。一旦確診為VHL病，則要終生隨訪。（3）.家族性 CNS HB患者的發(fā)病與VHL基因的突變有關，外周血 VHL基因 mRNA表達水平的下降可能可做為該病的診斷依據(jù)及預后判斷指標之一。（4）.顯微手術切除是CNS HB主要治療手段，立體定向放射治療可作為補充治療方法，無明顯臨床癥狀的、病灶小的可進行密切追蹤隨訪，生物免疫靶向治療

13、研發(fā)可能是一種理想的輔助治療方法。（5）.在CNS HB組織的生物活動過程中正負調控、刺激應答、生物粘附、酶調節(jié)活性、結構分子活性、免疫系統(tǒng)進程等功能明顯上調，而且化學趨化活性、核染色質的結構和動力學、細胞運動功能只存在于CNS HB腫瘤中；但是翻譯調節(jié)活性、細胞周期控制、代謝過程、發(fā)育過程、信號傳遞、細胞和染色體分裂等功能卻較正常腦組織是下調或喪失。在參與這些功能信息中最有代表性、并且是首次發(fā)現(xiàn)與CNS HB發(fā)生、發(fā)展密切相關蛋白有：