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文檔簡介
1、目的: 分析家族性CNS HB家系的流行病學(xué)及臨床特點(diǎn),闡述診治方法的可行性,探尋發(fā)病機(jī)制。
方法: (1)對一個(gè)家族性CNS HB的38名家族成員進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查,體格檢查和影像學(xué)篩查。(2)對該家族中7名CNS HB患者的病史、臨床表現(xiàn)、影像學(xué)資料及診斷治療方法、隨訪進(jìn)行描述和分析。(3)應(yīng)用光鏡、電鏡及免疫組織化學(xué)染色對4例進(jìn)行手術(shù)的CNS HB患者的腫瘤組織和6例外傷腦組織(作為對照)進(jìn)行病理學(xué)檢查。(4)抽取該 CN
2、S HB家系共38位成員及30例健康對照者的外周血,提取DNA和RNA,用PCR方法擴(kuò)增 VHL基因外顯子1及2并進(jìn)行測序;用Real-time PCR法測定外周血細(xì)胞中 VHL mRNA表達(dá)水平。(5)對所獲取的CNS HB的腫瘤組織和對照組正常腦組織進(jìn)行蛋白質(zhì)提取、酶解,應(yīng)用Label-free蛋白組學(xué)方法進(jìn)行定量分析,同時(shí)對篩選出的差異蛋白進(jìn)行生物信息分析。
結(jié)果: (1)該家系成員中現(xiàn)存有7例發(fā)病,年齡14~53歲,平
3、均36.5歲,外顯率10/38(26.3%),男性發(fā)病比女性多見(6:4),CNS HB占90%,且多發(fā)性HBs占20%;遺傳可能來自父系(I2成員)。(2)7例患者均未合并其它部位病變,其中6例為實(shí)質(zhì)性腫瘤,2例為囊性腫瘤;5例患者的腫瘤位于小腦半球、延髓和腦干旁,1例位于頸部脊髓,1例位于視網(wǎng)膜;4例患者共進(jìn)行7次顯微手術(shù),切除血管母細(xì)胞瘤10枚,術(shù)后隨訪8年;先證者在術(shù)后6年異位復(fù)發(fā),未予處理,繼續(xù)隨訪;1例進(jìn)行激光治療視網(wǎng)膜血管
4、瘤;2例癥狀不明顯進(jìn)行隨訪在隨訪中未見新發(fā)病灶,原病灶也未增大;復(fù)發(fā)率為42.8%(3/7)。(3)病理學(xué)特征:HE染色可見腫瘤由豐富的毛細(xì)血管和間質(zhì)細(xì)胞構(gòu)成,胞漿呈空泡狀或泡沫狀,未見異型核的瘤細(xì)胞。波形蛋白、血管內(nèi)皮生長因子受體、α抑制素、烯醇化酶染色在HB間質(zhì)細(xì)胞均呈強(qiáng)陽性表達(dá); CD31、CD34及vimentin在HB內(nèi)皮細(xì)胞均呈強(qiáng)陽性表達(dá);但是膠質(zhì)纖維酸性蛋白、角蛋白抗原、上皮膜抗原染色在CNS HB表達(dá)均呈陰性。Ki-67
5、標(biāo)記指數(shù),除1例第二次手術(shù)為2%,余均為l%。電鏡觀察:可見內(nèi)皮細(xì)胞呈扁平形,較幼稚,細(xì)胞核較大,染色淡,胞漿內(nèi)可見到Weibel-Palade小體;周細(xì)胞位于內(nèi)皮細(xì)胞外側(cè),靠近血管腔,體積較內(nèi)皮細(xì)胞小,核呈卵圓形,細(xì)胞漿較少,細(xì)胞周圍有一層完整的基底膜包繞。間質(zhì)細(xì)胞呈橢圓形,表面不規(guī)則,細(xì)胞核大,染色深,細(xì)胞漿中有豐富的脂滴空泡。(4)在此CNS HB家系成員中,7位發(fā)病者在 VHL外顯子1均測出位為5’端非編碼區(qū)第19位核苷酸發(fā)生
6、A→G的突變;與健康對照組相比,VHL基因 mRNA表達(dá)水平明顯降低,其中家系成員中已發(fā)病者VHL基因mRNA表達(dá)水平(0.062)與未發(fā)病者(0.26)比下降更為明顯。(5)分離鑒定出CNS HB組可信蛋白和肽段分別為385和2195個(gè);正常組可信蛋白和肽段分別是663和3662個(gè)。定量分析、差異匹配篩選出差異蛋白只在CNS HB中表達(dá)的有3個(gè)(vimentin、TPM4及SERPING1);在HB和對照組織中都表達(dá)的13個(gè)蛋白質(zhì)中,
7、有3個(gè)蛋白在HB組織中表達(dá)上調(diào)(HBB、ALB及HBD)、11個(gè)蛋白表達(dá)下調(diào)(如HSP、ATP、PEBP1、FTL、SOD2、PARK7、KRT1 Keratin、Putative等);只在對照組織中表達(dá)的有3個(gè)蛋白(Tubulin beta-4 chain、14-3-3及CA1)。在GO功能分析中,參與生物過程(Biological Process,BP)分析提示,生物學(xué)過程正負(fù)調(diào)控、刺激應(yīng)答、生物粘附、免疫系統(tǒng)過程的功能明顯增強(qiáng)和代
8、謝過程、發(fā)育過程、信號傳遞、細(xì)胞進(jìn)程功能的降低與家族性CNS HB形成有關(guān)。在基因分子功能(Molecular Function,MF)分析得出,生物趨化活性功能只在腫瘤組出現(xiàn);而翻譯調(diào)節(jié)活性功能在腫瘤組中缺失;在細(xì)胞成分分析(CC)結(jié)果顯示在CNS HB組織中細(xì)胞外區(qū)、細(xì)胞外基質(zhì)中的蛋白數(shù)量明顯高于對照組;而神經(jīng)突觸部分和神經(jīng)元突觸則明顯低于正常對照組。應(yīng)用COG分析(蛋白相鄰類的聚簇)得出結(jié)果是:“核染色質(zhì)結(jié)構(gòu)和動力學(xué)”(B類)與“
9、細(xì)胞動力學(xué)”(N類)功能只在CNS HB組織中發(fā)現(xiàn);但是“細(xì)胞周期調(diào)控”、“細(xì)胞分裂”和“染色體分解”(D類)、“輔酶的轉(zhuǎn)運(yùn)和新陳代謝”(H類)、“次級代謝生物合成”和“轉(zhuǎn)運(yùn)及分解代謝”(Q類),這些功能只在正常對照組中出現(xiàn),因此我們推測家族性CNS HB的發(fā)生、發(fā)展、易反復(fù)復(fù)發(fā)可能與B類和N類功能表達(dá)上調(diào),D類的失控、H類和Q類的功能異常相關(guān)。同時(shí)發(fā)現(xiàn)高遷移率族蛋白1、組蛋白H2A、SERPING l、原肌球蛋白α-4、波形蛋白僅在C
10、NS HB中表達(dá),這5個(gè)蛋白可能是直接參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程:高遷移率族蛋白1和原肌球蛋白4可能是通過促進(jìn)細(xì)胞遷移、分化和樹突狀細(xì)胞的高表達(dá)、調(diào)節(jié)蛋白酶活性等來促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展、浸潤及復(fù)發(fā);H2A高表達(dá)和PCBPl的調(diào)節(jié)活性的喪失,激活缺氧信號通路,上調(diào)HIF-la,促使間質(zhì)細(xì)胞向外分泌EPO及VEGF和α-珠蛋白mRNA的不穩(wěn)定,促進(jìn)HB的形成。SERPINGl基因在CNS HB中顯著上調(diào)可能是促進(jìn)該腫瘤生長及瘤周水腫的原因之一。
11、PURA所起到的轉(zhuǎn)錄、翻譯調(diào)節(jié)活性在CNS HB中的缺失或失調(diào),導(dǎo)致細(xì)胞增殖、生長異常、神經(jīng)元變性壞死、血管平滑肌和α-肌動蛋白基因的轉(zhuǎn)錄活性不能被抑制,而參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。
結(jié)論: (1).家族性中樞神經(jīng)系統(tǒng)血管母細(xì)胞瘤是嚴(yán)重危害患者及其家族成員的一種具有遺傳性的VHL病;發(fā)病年齡較輕,多發(fā)病灶,易復(fù)發(fā),對于每個(gè)懷疑有家族史的CNS HB患者都要對其家系成員進(jìn)行普查,包括影像學(xué)、基因生物學(xué)及蛋白組學(xué)檢測。(2).家族性中
12、樞神經(jīng)系統(tǒng)血管母細(xì)胞瘤即VHL病的正確診斷需要結(jié)合家族史、臨床表現(xiàn)、MRI檢查和病理學(xué)檢測以及 VHL基因檢測。一旦確診為VHL病,則要終生隨訪。(3).家族性 CNS HB患者的發(fā)病與VHL基因的突變有關(guān),外周血 VHL基因 mRNA表達(dá)水平的下降可能可做為該病的診斷依據(jù)及預(yù)后判斷指標(biāo)之一。(4).顯微手術(shù)切除是CNS HB主要治療手段,立體定向放射治療可作為補(bǔ)充治療方法,無明顯臨床癥狀的、病灶小的可進(jìn)行密切追蹤隨訪,生物免疫靶向治療
13、研發(fā)可能是一種理想的輔助治療方法。(5).在CNS HB組織的生物活動過程中正負(fù)調(diào)控、刺激應(yīng)答、生物粘附、酶調(diào)節(jié)活性、結(jié)構(gòu)分子活性、免疫系統(tǒng)進(jìn)程等功能明顯上調(diào),而且化學(xué)趨化活性、核染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)和動力學(xué)、細(xì)胞運(yùn)動功能只存在于CNS HB腫瘤中;但是翻譯調(diào)節(jié)活性、細(xì)胞周期控制、代謝過程、發(fā)育過程、信號傳遞、細(xì)胞和染色體分裂等功能卻較正常腦組織是下調(diào)或喪失。在參與這些功能信息中最有代表性、并且是首次發(fā)現(xiàn)與CNS HB發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)蛋白有:
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