Trop2對(duì)小鼠骨密質(zhì)來(lái)源間充質(zhì)干細(xì)胞體外增殖、分化影響的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、研究背景和目的:
　　干細(xì)胞參與胚胎發(fā)育的全過(guò)程,同時(shí)也存在于一些成體器官中,是由一群未分化的、持續(xù)自我更新的細(xì)胞組成。間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)最初分離自骨髓,是一群可以向骨、軟骨、脂肪及肌等分化的成體干細(xì)胞,這些細(xì)胞在多次分裂之后仍具備多向分化的能力。目前 MSCs已被許多的研究者,采用不同的方法從眾多的器官組織中分離獲得。由于這些成體干細(xì)胞至今仍沒(méi)有發(fā)現(xiàn)其特異的表面標(biāo)志物,通常只能采用一系列細(xì)胞表面標(biāo)志的組合來(lái)間接進(jìn)行鑒定,為其

2、高效的體外分離與擴(kuò)增帶來(lái)諸多不便。因此,找到真正能體現(xiàn) MSCs自我更新與分化功能的“干性標(biāo)志”,并闡明其調(diào)控途徑將有利于對(duì)其自我更新與分化的分子機(jī)制的理解,有利于 MSCs基于細(xì)胞治療的臨床應(yīng)用的發(fā)展。最近的研究提示,Trop2或許是一種新的干性標(biāo)志。Trop2是隸屬于 TASTCAD基因家族的細(xì)胞表面糖蛋白,最初被發(fā)現(xiàn)表達(dá)于上皮細(xì)胞,通常也過(guò)表達(dá)于一些上皮來(lái)源的腫瘤組織,與腫瘤的發(fā)生及侵襲密切相關(guān)。最近有研究發(fā)現(xiàn) Trop2還表達(dá)于

3、“祖細(xì)胞樣的/干細(xì)胞樣的”人與小鼠的前列腺基底細(xì)胞和肝卵圓細(xì)胞上,并發(fā)現(xiàn)只有這些高表達(dá) Trop2的細(xì)胞才表現(xiàn)出自我更新和向下分化的潛能。這一現(xiàn)象表明,或許Trop2參與維系這些“干細(xì)胞樣的”細(xì)胞的自我更新。盡管目前對(duì) Trop2激活其下游信號(hào)通路的確切機(jī)制還沒(méi)有完全明確,但是其胞尾區(qū)的PIP2結(jié)合域提示, PI3K/AKT信號(hào)通路可能在其中起某種作用。本研究的目的是:明確是否小鼠基質(zhì)干細(xì)胞也可以合成 Trop2,并探討 Trop2對(duì)小

4、鼠骨密質(zhì)來(lái)源的MSC生物學(xué)作用的影響。
　　研究方法:
　　1.采用骨片法分離獲取小鼠MSCs,對(duì)其進(jìn)行免疫表型鑒定和成脂及成骨誘導(dǎo)分化。
　　2.通過(guò)免疫熒光染色,利用激光共聚焦顯微鏡觀察 Trop2在小鼠MSCs細(xì)胞膜上的定位表達(dá);通過(guò) Western Blot檢測(cè)小鼠骨密質(zhì)來(lái)源 MSCs不同培養(yǎng)時(shí)期 Trop2的表達(dá)變化。
　　3.建立 Trop2基因敲除(Trop2 KO)小鼠模型,通過(guò) RT-PCR、S

5、outhern Blot、Western Blot等方法分別從 DNA、RNA、蛋白表達(dá)水平進(jìn)行鑒定。
　　4.利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)并比較 Trop2基因敲除小鼠來(lái)源 MSCs和野生型(WT)小鼠MSCs表型差異。
　　5.通過(guò) CCK-8和CFSE檢測(cè)并比較 Trop2基因敲除小鼠來(lái)源 MSCs和WT小鼠MSCs細(xì)胞增殖能力的差異。
　　6.通過(guò) RT-PCR和real-time PCR比較 Trop2基因敲除小鼠來(lái)源

6、 MSCs和WT小鼠MSCs在經(jīng)過(guò)完全成脂和成骨誘導(dǎo)之后,成脂標(biāo)志基因 PPAR-γ2、Adipsin和成骨標(biāo)志基因 Osteocalcin、Osteopontin的定量表達(dá)差異;通過(guò)特異性的油紅“O”和茜素紅染色來(lái)判別 Trop2基因敲除小鼠來(lái)源 MSCs和WT小鼠MSCs在經(jīng)過(guò)完全成脂和成骨誘導(dǎo)后脂滴聚集和礦物質(zhì)沉積的差異。
　　7.通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)明確 Trop2基因敲除小鼠來(lái)源 MSCs和WT小鼠MSCs進(jìn)入細(xì)胞周期S期細(xì)胞

7、百分?jǐn)?shù)的差異;通過(guò) Western Blot明確在傳代培養(yǎng)過(guò)程中Trop2基因敲除小鼠來(lái)源 MSCs和WT小鼠MSCs活化 AKT表達(dá)比率的差異,以及AKT通路下游Cyclin D1的表達(dá)差異;利用PI3K抑制劑 LY294002處理WT小鼠MSCs后明確活化AKT表達(dá)比率的差異以及其下游 Cyclin D1的表達(dá)差異,并將其與 Trop2基因敲除小鼠來(lái)源 MSCs進(jìn)行比較,明確 Trop2對(duì) AKT/Cyclin D1通路的影響。

8、r>　　研究結(jié)果:
　　1.骨片法可成功體外分離獲取小鼠MSCs,所獲取的MSCs不僅具備通過(guò)經(jīng)典方法獲取的MSCs的免疫表型特征,而且還可以向脂肪和骨誘導(dǎo)分化,是同質(zhì)性比較一致的間充質(zhì)干細(xì)胞。
　　2.通過(guò)激光共聚焦顯微鏡首次明確觀察到 MSCs細(xì)胞膜上 Trop2的定位表達(dá),通過(guò) Western Blot發(fā)現(xiàn) Trop2的表達(dá)量隨 MSCs體外分裂次數(shù)的增加而減少。
　　3.通過(guò) RT-PCR、Southern B

9、lot、Western Blot明確鑒定了Trop2基因敲除小鼠的構(gòu)建成功。
　　4.通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)、RT-PCR、real-time PCR、Western Blot等檢測(cè)發(fā)現(xiàn),Trop2基因敲除小鼠和WT小鼠來(lái)源的MSCs在以下方面存在明顯差異:
　　(1)通過(guò)表型觀察發(fā)現(xiàn):與 WT MSCs相比,KO MSCs在第一代時(shí)同質(zhì)性較差,CD45陽(yáng)性細(xì)胞(造血系細(xì)胞)混雜較多;隨著傳代至第4代后其同質(zhì)性漸趨一致。
　　

10、(2) CCK-8和CFSE檢測(cè)發(fā)現(xiàn):與 WT MSCs相比,KO MSCs的增殖速率明顯降低,細(xì)胞倍增時(shí)間明顯延長(zhǎng)。
　　(3)成脂與成骨誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn):與 WT MSCs相比, KO MSCs在相同誘導(dǎo)之后脂滴聚集減少,礦物質(zhì)沉積減少; real-time PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)經(jīng)完全誘導(dǎo)后 WT MSCs較來(lái)源于 KO MSCs的脂肪標(biāo)志基因 Adipsin、 PPAR-γ2和骨標(biāo)志基因 Osteocalcin、 Osteoponti

11、n分別高出400％、500％、350％和100％。
　　(4)細(xì)胞周期:與 WT MSCs相比,KO MSCs進(jìn)入細(xì)胞周期 S期的細(xì)胞比率明顯降低。
　　(5) AKT/Cyclin D1:與 WT MSCs相比,KO MSCs活化 AKT的表達(dá)比率明顯降低,AKT信號(hào)通路下游細(xì)胞周期關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)蛋白 Cyclin D1的表達(dá)明顯降低;但活化 AKT和Cyclin D1表達(dá)降低程度不及經(jīng) LY294002阻斷 AKT通路所引起的