淋病奈瑟菌NspA-LTB核酸疫苗免疫活性研究.pdf

1、【目的】利用已構(gòu)建的真核重組質(zhì)粒 pcDNA3.1(-)/ltB、pcDNA3.1(-)/nspA及pcDNA3.1(-)/ltB-nspA，通過鼻飼途徑免疫BALB/c小鼠，觀察其在小鼠鼻粘膜細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)，檢測其所誘發(fā)的特異性體液免疫應(yīng)答（尤其是粘膜免疫應(yīng)答）和細(xì)胞免疫應(yīng)答水平，為研制高效的淋球菌核酸疫苗提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　【方法】①真核質(zhì)粒的鑒定。提取真核重組質(zhì)粒 pcDNA3.1(-)/nspA、pcDNA3.1(-)/lt

2、B、pcDNA3.1(-)/ltB-nspA行PCR及雙酶切鑒定。②觀察真核重組質(zhì)粒在小鼠鼻粘膜細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)。真核重組質(zhì)粒 pcDNA3.1(-)/ltB、pcDNA3.1(-)/nspA及pcDNA3.1(-)/ltB-nspA，通過鼻飼途徑免疫BALB/c小鼠，末次免疫后2w取小鼠鼻粘膜采用免疫組織化學(xué)法檢測NspA、LTB、LTB-NspA蛋白的表達(dá)。③nspA-ltB核酸疫苗免疫活性的檢測。取真核重組質(zhì)粒 pcDNA3.1(-)

3、/nspA、pcDNA3.1(-)/ltB-nspA鼻飼免疫 BALB/c小鼠，同時(shí)設(shè)對照組 pcDNA3.1(-)/ltB、pcDNA3.1(-)和PBS組，共免疫3次。每次免疫前一天及末次免疫后2w經(jīng)小鼠尾靜脈采血，分離血清，間接ELISA法檢測血清中NspA特異性IgG抗體水平；同時(shí)用PBS沖洗小鼠生殖道，收集其生殖道沖洗液，間接ELISA法檢測沖洗液中NspA特異性SIgA抗體水平。末次免疫后2w取小鼠脾淋巴細(xì)胞于37℃5％CO

4、2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)后，MTT法檢測淋巴細(xì)胞增殖水平，間接ELISA法檢測脾淋巴細(xì)胞培養(yǎng)上清IFN-γ含量。
　　【結(jié)果】真核重組質(zhì)粒 pcDNA3.1(-)/nspA、 pcDNA3.1(-)/ltB和pcDNA3.1(-)/ltB-nspA，經(jīng)鼻飼途徑免疫BALB/c小鼠，末次免疫后2w采用免疫組織化學(xué)法檢測到重組蛋白在小鼠鼻粘膜細(xì)胞內(nèi)表達(dá)；實(shí)驗(yàn)組 pcDNA3.1(-)/nspA、pcDNA3.1(-)/ltB-nspA小鼠生殖道

5、沖洗液中NspA特異性SIgA水平明顯高于對照組（P<0.01），且含粘膜佐劑的pcDNA3.1(-)/ltB-nspA組較單基因pcDNA3.1(-)/nspA組高（P<0.05）。實(shí)驗(yàn)組小鼠血清中 NspA特異性IgG抗體明顯高于對照組(P<0.01)；但pcDNA3.1(-)/ltB-nspA組與單基因pcDNA3.1(-)nspA組比較，特異性IgG抗體水平差異不顯著（P>0.05）。實(shí)驗(yàn)組小鼠脾淋巴細(xì)胞經(jīng)特異性NspA抗原刺激

6、后，培養(yǎng)上清中 IFN-γ含量明顯高于對照組(P<0.01)[pcDNA3.1(-)/nspA組達(dá)153.79±19.03pg/mL，pcDNA3.1(-)/ltB-nspA組達(dá)160.56±25.67pg/mL，與pcDNA3.1(-)/ltB組(60.56±11.45pg/mL)，空質(zhì)粒組 pcDNA3.1(-)(40.34±9.89pg/mL)和PBS組(25.75±6.12pg/mL)之間有顯著性差異(P<0.01)，兩實(shí)驗(yàn)組間

7、 IFN-γ含量差異不顯著(P>0.05)。MTT法檢測脾淋巴細(xì)胞增殖水平， pcDNA3.1(-)/ltB-nspA組和pcDNA3.1(-)/nspA組小鼠脾淋巴細(xì)胞經(jīng)特異性NspA抗原刺激后，刺激指數(shù)分別為(1.653±0.32)和(1.598±0.25)，明顯高于對照組[pcDNA3.1(-)/ltB組(1.122±0.21)，空質(zhì)粒組pcDNA3.1(-)(1.134±0.17)和PBS組(1.014±0.10)(P<0.01

8、)]，兩實(shí)驗(yàn)組間刺激指數(shù)差異不顯著(P>0.05)。
　　【結(jié)論】
　　1、用構(gòu)建好的pcDNA3.1(-)/nspA、pcDNA3.1(-)/ltB-nspA核酸疫苗，通過鼻飼途徑免疫BALB/c小鼠，能夠誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生較強(qiáng)的特異性體液免疫應(yīng)答（尤其是粘膜免疫應(yīng)答）和細(xì)胞免疫應(yīng)答。
　　2、真核重組質(zhì)粒pcDNA3.1(-)/ltB、pcDNA3.1(-)/nspA及pcDNA3.1(-)/ltB-nspA，通過鼻飼途