ASCs結(jié)合可降解PLLA-PCL納米纖維支架構(gòu)建功能性尿道的可行性研究.pdf

1、研究背景與目的:平滑肌是尿道的主要功能成分。平滑肌細(xì)胞是一種終末分化細(xì)胞，一旦受損后很難再生，而且也缺乏合適可替代的肌體組織，因此修復(fù)長(zhǎng)段尿道的缺損一直是臨床上的難題。有些研究者嘗試通過脈管系統(tǒng)活檢獲得平滑肌細(xì)胞，然后在體外培養(yǎng)擴(kuò)增細(xì)胞，制備具有機(jī)械性能和收縮功能的組織工程肌肉組織。然而這些成熟的平滑肌細(xì)胞在體外增殖能力有限，而且多次分化后，容易失去其收縮能力。最為重要的是，體外培養(yǎng)出來的平滑肌排列無規(guī)律，因此細(xì)胞收縮時(shí)，所有細(xì)胞不能朝

2、同一方向收縮，難以實(shí)現(xiàn)平滑肌細(xì)胞群整體的收縮功能。通過組織工程的方法來制備功能性的尿道，需要解決的兩個(gè)重要的問題就是尋找到理想的種子細(xì)胞和合適支架材料，進(jìn)而培育出具有方向性排列的平滑肌細(xì)胞群。
　　 干細(xì)胞是一類處于未分化狀態(tài)的細(xì)胞，它們具有自我更新能力，而且在一定條件下，能向多種成熟細(xì)胞類型分化。盡管胚胎干細(xì)胞（ESCs）具有多向分化的潛能，但受倫理、宗教、道德和法律的制約，它們的使用受到限制。自成體組織來源的成體干細(xì)胞就不受

3、這些因素的制約，而且因?yàn)榭梢詮淖泽w組織取材，能避開免疫排斥反應(yīng)。脂肪干細(xì)胞(ASCs)就是一種存在于機(jī)體脂肪組織的成體干細(xì)胞，它們能夠比較容易的從脂肪組織提取，而且體外培養(yǎng)時(shí)，顯示了很強(qiáng)的增殖能力和向多種細(xì)胞類型分化的潛能。例如向脂肪、骨、軟骨、骨骼肌、平滑肌組織分化。而且ASCs具有易于大量獲得、取材方便的優(yōu)點(diǎn)，因此可作為用于尿道重建組織工程的“種子細(xì)胞”。
　　 良好的生物材料支架植入機(jī)體后，能夠與細(xì)胞、機(jī)體組織和諧共存。種

4、子細(xì)胞與支架材料在體外共培養(yǎng)后，植入體內(nèi)受損組織部位，能夠?qū)C(jī)體大塊組織缺損進(jìn)行修補(bǔ)。支架材料分為非可降解材料和可降解材料兩類。非可降解材料不能被機(jī)體吸收而留在體內(nèi)，往往不能很好的替代機(jī)體組織的功能，如自我更新，新陳代謝及自我優(yōu)化能力等?？山到獠牧夏軐?duì)受損組織進(jìn)行形態(tài)、結(jié)構(gòu)及功能上的修復(fù)，它們降解為對(duì)機(jī)體無毒害的CO2和水分子，僅留下支架材料上搭載的細(xì)胞與組織融合。本實(shí)驗(yàn)所用的PLLA/PCL材料（聚乳酸/聚已內(nèi)酯）是可降解的聚乳酸(P

5、LLA)和聚已內(nèi)酯(PCL)的共混,通過調(diào)整兩者的比例可以控制合成材料的柔韌性、伸展性和降解時(shí)間，因而制備出組織修復(fù)與重建理想的可降解生物支架。
　　 本課題應(yīng)用PLLA、PCL作為原材料，應(yīng)用靜電紡絲技術(shù)制備具有方向性的納米纖維細(xì)胞支架，并采用不同細(xì)胞外基質(zhì)來改良材料的粘附性能，體外將自體ASCs在納米支架上誘導(dǎo)為平滑肌細(xì)胞，以期在體外構(gòu)建出具有整體收縮功能的平滑肌細(xì)胞群移植物。實(shí)驗(yàn)中研究了不同組份材料與細(xì)胞及組織的生物相容性

6、，細(xì)胞外基質(zhì)對(duì)材料細(xì)胞親和力以及ASCs向SMCs分化的影響。而且成功將ASCs誘導(dǎo)為平滑肌細(xì)胞（AD-SMCs）后，將帶AD-SMCs支架接種于兔尿道缺損模型，比較移植前后兔尿道壓變化，為探討ASCs結(jié)合方向性PLLA/PCL納米纖維支架構(gòu)建功能性尿道的可行性打下了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　 材料和方法:
　　 一．ASCs分離、培養(yǎng)、鑒定和PLLA/PCL納米纖維支架篩選。
　　 1．ASCs的分離及培養(yǎng)采用從新西蘭大

7、白兔（雌、雄各半）腹股溝區(qū)皮下脂肪、頸背部皮下脂肪、腎臟周圍脂肪組織分離出的ASCs作為實(shí)驗(yàn)細(xì)胞。ASCs分離技術(shù)參照Zuk的方法[1]：將兔不同部位取材的新鮮脂肪組織（約1.5g）置入無菌PBS液沖洗后，在含10％FBS的DMEM中剪成1-2mm碎塊；無菌PBS反復(fù)洗脫，去除混雜的血細(xì)胞和脂肪細(xì)胞；置于振蕩器內(nèi)，37℃下0.1％膠原酶消化2小時(shí)；等體積含10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中止膠原酶反應(yīng)；250g離心10分鐘，取下層細(xì)胞團(tuán)塊

8、；含有10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基分散細(xì)胞團(tuán)塊，將細(xì)胞濃度調(diào)整至1*106/ml后移入無菌培養(yǎng)瓶中；37℃、5％CO2、飽和濕度細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
　　 2．ASCs鑒定流式細(xì)胞儀檢測(cè)體外培養(yǎng)ASCs表面的干細(xì)胞標(biāo)記性分子CD106、CD166；細(xì)胞免疫組織化學(xué)檢測(cè)CD31、CD45、CD105。
　　 3．不同部位ASCs體外增殖能力的比較MTT法檢測(cè)從腹股溝區(qū)皮下脂肪、頸背部皮下脂肪、腎臟周圍脂肪組織分離出的ASC

9、s第2代細(xì)胞第1、2、3、4、5、6、7天的增殖情況，比較三個(gè)不同部位來源ASCs增殖能力的差異。
　　 4．PLLA/PCL納米纖維支架的制備利用靜電紡絲的方法制備PLLA/PCL納米纖維支架。參考Ma的方法[11]，基本步驟如下：取10ml的20％的PLLA/PCL氯仿溶液，加入20ml的注射器，注射器由氣泵勻速推注(0.5ml/h),使溶液通過一20G（內(nèi)徑0.21mm）的針頭。在針頭與接收納米纖維的鋁片之間（距離20-4

10、0cm）加高電壓（15kv），這樣PLLA/PCL氯仿溶液就會(huì)從針頭高速噴出。在其向接收裝置運(yùn)動(dòng)的過程中，溶劑氯仿迅速蒸發(fā)，鋁片上收集到飄落的PLLA/PCL納米纖維。當(dāng)接收納米纖維的鋁片改為一勻速旋轉(zhuǎn)的接收裝置（鋁盤）時(shí)，納米纖維便能以一定的方向排列在鋁盤上。鋁片上PLLA/PCL納米纖維絲聚集到一定厚度（0.2-0.4mm）時(shí)收集材料。掃描電鏡將用于納米纖維的形態(tài)觀察。
　　 二．細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)改良PLLA/PCL納米

11、纖維支架性能
　　 1．不同ECM（明膠、膠原、層粘連蛋白(LN)、纖維鏈接蛋白(FN)、高濃度多聚賴氨酸、低濃度多聚賴氨酸）處理96孔板及1：1 PLLA/PCL納米纖維支架，MTT法檢測(cè)不同ECM處理前后，96孔板中細(xì)胞增殖能力變化；免疫熒光染色及掃描電鏡比較支架材料不同ECM處理前后，細(xì)胞粘附能力變化。
　　 2．不同ECM（明膠、膠原、層粘連蛋白(LN)、纖維鏈接蛋白(FN)、高濃度多聚賴氨酸、低濃度多聚賴氨酸）

12、預(yù)處理培養(yǎng)皿后種植ASCs，在平滑肌誘導(dǎo)培養(yǎng)基(SMIM)中誘導(dǎo)ASCs向平滑肌方向分化。RT-PCR和Realtime-PCR檢測(cè)不同時(shí)相，普通培養(yǎng)皿和ECM處理培養(yǎng)皿內(nèi)誘導(dǎo)細(xì)胞平滑肌特異性標(biāo)記基因（Calponin、SM22、a-SMA、MHC）mRNA的表達(dá)及表達(dá)量的變化；Westernblot檢測(cè)其蛋白質(zhì)的表達(dá)水平。進(jìn)而比較不同ECM對(duì)ASCs向平滑肌方向分化的影響。
　　 三．方向性PLLA/PCL納米纖維支架上ASC

13、s成平滑肌分化及兔尿道重建
　　 1．制備具有方向性的PLLA/PCL納米纖維支架，掃描電鏡檢測(cè)材料的方向性。
　　 2．ASCs與方向性的PLLA/PCL納米纖維支架在普通培養(yǎng)基（DMEM）中共培養(yǎng)，免疫熒染色、掃描電鏡及MTT法檢測(cè)材料上細(xì)胞的粘附、增殖。
　　 3.ASCs結(jié)合使用或不使用LN預(yù)處理的PLLA/PCL納米纖維支架在平滑肌誘導(dǎo)培養(yǎng)基（SMIM）中共培養(yǎng)，掃描電鏡觀察LN處理前后，ASCs的粘附

14、、分化及誘導(dǎo)出的平滑?。ˋD-SMCs）的排列。
　　 4.兔尿道狹窄模型的建立及帶細(xì)胞支架兔尿道修復(fù)應(yīng)用鈥激光在直視下對(duì)兔尿道行破壞，術(shù)后3-4周逆行尿路造影顯示尿道狹窄形成。從該兔腹股溝區(qū)取脂肪組織，分離出ASCs 并在體外培養(yǎng)增殖。將擴(kuò)增的細(xì)胞種植于方向性纖維支架上，普通培養(yǎng)基（DMEM）內(nèi)培養(yǎng)一周，細(xì)胞增殖密集后，換用誘導(dǎo)培養(yǎng)基（SMIM）誘導(dǎo)ASCs向平滑肌分化。成功誘導(dǎo)ASCs 為AD-SMCs后，將帶細(xì)胞支架移植于

15、ASCs 來源兔尿道內(nèi)，不同時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)兔尿道壓變化（2周、8周），并與尿道狹窄模型建立前，兔尿道壓相對(duì)比，評(píng)估帶細(xì)胞支架的治療效果。
　　 結(jié)果：
　　 1．從兔三個(gè)不同部位分離出的細(xì)胞都具有脂肪干細(xì)胞典型的三角形或梭形外觀，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面CD106、CD166 陽性率同脂肪干細(xì)胞吻合。
　　 2．不同部位ASCs 體外增殖能力MTT 法檢測(cè)，差異有顯著性（P<0.05）。頸背部增殖能力最強(qiáng)，其次為腹股溝

16、區(qū)，腹膜后脂肪來源（腎周脂肪）增殖能力最弱。
　　 3．電鏡下觀測(cè)靜電紡絲技術(shù)成功制備出具有方向性的纖維支架材料。
　　 4．免疫熒光活死細(xì)胞染色（Live/Dead Stain）檢測(cè)，不同組分PLLA/PCL納米纖維支架均無明顯細(xì)胞毒性。免疫熒光活死細(xì)胞染色和掃描電鏡觀測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)（1、2、3天）固定面積視野細(xì)胞計(jì)數(shù)，1：1 支架材料細(xì)胞粘附能力最強(qiáng)，不同材料上細(xì)胞增殖能力沒有明顯差異。
　　 5．不同支架材料

17、種植與SD 大鼠背部皮下后，第5天、第2、3、4、6、8、12周免疫組化染色。僅僅第5天時(shí)，炎性因子CD31、CD45、CD68 有陽性表達(dá)，第2、3、4、6、8、12周免疫組化檢測(cè)炎癥因子CD31、CD45、CD68 均無明顯陽性表達(dá)，并觀察到材料逐漸破碎降解，第12周時(shí)，基本看不到組織中材料成分，而且材料種植部位無肉芽組織形成。
　　 6．倒置像差顯微鏡下，計(jì)數(shù)不同ECM 處理材料（1：1 材料）后，相同面積材料上粘附的細(xì)胞

18、數(shù)與未用ECM 處理材料上細(xì)胞數(shù)對(duì)比，ECM 處理后各組相同面積材料粘附數(shù)與未處理組有明顯差異。
　　 7．不同ECM 處理培養(yǎng)皿中細(xì)胞增殖能力與未處理培養(yǎng)皿中細(xì)胞增殖能力對(duì)比，PLL 高濃度組、PLL 低濃度組、FN組與對(duì)照組有明顯差異；明膠、膠原、LN 處理組與對(duì)照組無明顯差異。
　　 8．不同ECM 處理培養(yǎng)皿后接種ASCs，在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中誘導(dǎo)6周。Realtime-PCR檢測(cè)顯示不同ECM 處理組，平滑肌特異性基

19、因表達(dá)水平均隨誘導(dǎo)時(shí)間延長(zhǎng)而升高，6周時(shí)各種處理因素平滑肌特異性基因表達(dá)水平達(dá)到基本一致水平（成功誘導(dǎo)為SMCs）。LN、明膠、膠原能加速平滑肌細(xì)胞特異性基因表達(dá)。平滑肌細(xì)胞Western blot 檢測(cè)顯示LN、明膠、膠原組誘導(dǎo)2w 檢測(cè)出calponin；FN、PLL（高、低濃度）、對(duì)照組2w 未檢測(cè)到calponin。明膠、膠原、LN、正常對(duì)照組細(xì)胞誘導(dǎo)3w 檢測(cè)SM22；PLL(高、低濃度)、FN 處理組未檢測(cè)出。PLL(高、低

20、濃度)、FN、膠原、LN、明膠組細(xì)胞誘導(dǎo)4w 檢測(cè)出a-actin。PLL(高、低濃度)、明膠、膠原、LN、FN組細(xì)胞誘導(dǎo)6w 檢測(cè)出MHC 蛋白表達(dá)。
　　 9．靜電紡絲技術(shù)結(jié)合電轉(zhuǎn)制備1：1 PLLA/PCL納米纖維支架，掃描電鏡下觀察支架上納米纖維具有一致的方向性。
　　 10．普通培養(yǎng)基中培養(yǎng)一周，免疫熒光染色、掃描電鏡檢測(cè)到1：1 方向性PLLA/PCL納米纖維支架材料上細(xì)胞數(shù)量逐漸增加。
　　 11．

21、1：1 方向性PLLA/PCL納米纖維支架材料上細(xì)胞在誘導(dǎo)培養(yǎng)基（MCDB131）中培養(yǎng)6周時(shí)，掃描電鏡檢測(cè)顯示支架材料上細(xì)胞排列具有方向性。細(xì)胞長(zhǎng)軸方向與支架材料上，納米纖維方向相同。
　　 12．鈥激光在直視下對(duì)家兔尿道進(jìn)行沖擊，術(shù)后3-4周兔尿道造影檢查可見尿道狹窄形成。將帶AD-SMCs的支架植入ASCs 來源的兔尿道，第2周與第8周檢測(cè)兔尿道壓，第2周時(shí)兔尿道壓顯示存在尿道狹窄，第8周時(shí)，部分兔（2/4）顯示正常兔尿道

22、壓。
　　 結(jié)論：
　　 1．腹股溝區(qū)來源ASCs 取材容易且增殖能力強(qiáng)，是合適的ASCs 來源。
　　 2．1：1 PLLA/PCL納米纖維支架無細(xì)胞毒性、細(xì)胞粘附性好、組織炎癥反應(yīng)小，是合適的生物支架。
　　 3．ECM 能改良材料的粘附性；LN、明膠、膠原能促進(jìn)ASCs 向平滑肌細(xì)胞分化。
　　 4．1：1 方向性PLLA/PCL納米纖維支架上能培養(yǎng)出具有方向性的平滑肌細(xì)胞。