可降解鐵支架可行性的初步研究.pdf

1、第一部分：
　　 鐵對人主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞增殖影響的體外實(shí)驗(yàn)研究
　　 藥物洗脫支架(DES)是介入心臟病學(xué)的重要進(jìn)展，使支架內(nèi)再狹窄率下降到10％以下。但DES中不能降解的多聚物涂層可能會(huì)引起炎癥反應(yīng)，DES攜載的抗細(xì)胞增殖藥物雖有效地抑制了支架置入術(shù)后血管平滑肌細(xì)胞過度增生，但同時(shí)也抑制了血管內(nèi)皮細(xì)胞再生，延遲內(nèi)皮愈合，從而增加支架內(nèi)血栓的風(fēng)險(xiǎn)。
　　 生物可降解支架可在完成其防止血管彈性回縮和藥物釋放的作用后

2、自行降解吸收，避免對血管舒縮功能的不利影響。目前用于可吸收的金屬支架的材料主要是鎂合金和鐵。鎂合金力學(xué)性能差于不銹鋼和鈷鉻合金，且分解吸收較快，使得支架在術(shù)后過早失去支撐功能。鐵的支撐力強(qiáng)于鎂，能有效預(yù)防早期血管彈性回縮。有研究證明，在豬的冠狀動(dòng)脈內(nèi)置入可降解鐵支架，顯示局部血管壁無炎癥反應(yīng)，血管內(nèi)膜無明顯增生。亦有體外細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)研究表明，鐵可抑制人血管平滑肌細(xì)胞的增殖。鐵有潛在可能成為可降解金屬支架的材料。鐵支架在降解過程中，支架表

3、面首先釋放出二價(jià)鐵，二價(jià)鐵可被氧化成三價(jià)鐵或與鄰近組織發(fā)生相互作用。由于支架被血管平滑肌細(xì)胞包圍，因此研究二價(jià)鐵和三價(jià)鐵對平滑肌細(xì)胞的影響具有重要意義。現(xiàn)有細(xì)胞培養(yǎng)研究表明，鐵通過減少血管平滑肌細(xì)胞生長相關(guān)基因mRNA的表達(dá)，起到抗平滑肌細(xì)胞增殖的作用，但目前尚缺乏蛋白水平的研究。
　　 目的：
　　 本研究通過體外實(shí)驗(yàn)，培養(yǎng)人主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞( HASMC)，WST-1法檢測不同濃度的葡萄糖酸亞鐵[可溶性二價(jià)鐵，F(xiàn)e(

4、Ⅱ)]和氯化鐵[可溶性三價(jià)鐵，F(xiàn)e(Ⅲ)]對HASMC增殖的影響。在蛋白水平上，通過檢測Fe(Ⅱ)和Fe(Ⅲ)干預(yù)后HASMC增殖蛋白PCNA和凋亡蛋白P53的表達(dá)，探討Fe(Ⅱ)]和Fe(Ⅲ)在增殖和凋亡方面對HASMC的影響。
　　 方法：
　　 一、WST-1法檢測Fe(Ⅱ)和Fe(Ⅲ)對HASMC增殖的影響
　　 通過體外擴(kuò)增、培養(yǎng)HASMC細(xì)胞株。Fe(Ⅱ)和Fe(Ⅲ)濃度分別為100μmol/L，20

5、0μmol/L,300μmol/L,400μmol/L,500μmol/L干預(yù)培養(yǎng)HASMC，干預(yù)6小時(shí)、12小時(shí)、24小時(shí)，WST-1法檢測細(xì)胞增殖活性，計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率，探討Fe(Ⅱ)和Fe(Ⅲ)對HASMC抑制增殖作用與時(shí)間、濃度的關(guān)系。使用SPSS10.0軟件統(tǒng)計(jì)分析。
　　 一、免疫印跡法( Western Blot)檢測Fe(Ⅱ)和Fe(Ⅲ)對細(xì)胞增殖蛋白PCNA和凋亡蛋白P53表達(dá)的影響
　　 HASMC

6、接種培養(yǎng)24小時(shí)后，分別加入Fe(Ⅱ)和Fe(Ⅲ)100μmol/L,300μmol／L,500μmol/L，正常對照組予含2%血清的SMCM培養(yǎng)。藥物干預(yù)6小時(shí)、12小時(shí)、24小時(shí)，提取細(xì)胞總蛋白。Western Blot法檢測HASMC的細(xì)胞增殖核抗原PCNA和凋亡蛋白P53的表達(dá)情況。
　　 結(jié)果：
　　 一、Fe(Ⅱ)和Fe(Ⅲ)對HASMC增殖的影響
　　 Fe(Ⅱ)和Fe(Ⅲ)對HASMC都表現(xiàn)出不同

7、程度的抑制HASMC增殖的作用，且呈濃度依賴性。Fe(Ⅱ)300umol/L,400umol/L和500umol/L干預(yù)6小時(shí)的增殖抑制率分別為34.25%,50.11%和50.80%，干預(yù)12小時(shí)的增殖抑制率分別為46.35%,58.19%和66.05%，干預(yù)24小時(shí)的增殖抑制率分別為32.74%,38.79%和49.28%。500umol/L組的抑制率在三個(gè)時(shí)間點(diǎn)分別是300umol/L組的1.48倍，1.43倍和1.51倍。Fe(

8、Ⅲ)100umol/L，200umol/L,300umol/L,400umol/L和500umol/L。干預(yù)6小時(shí)的增殖抑制率分別為21.70%,36.74%,41.45%,45.81%和47.49%，干預(yù)12小時(shí)的增殖抑制率分別為35.38%,49.97%,59.14%，65.77%和69.17%，干預(yù)24小時(shí)的增殖抑制率分別為11.57%，28.58%,38.93%,48.70%和55.42%。500umol/L組的抑制率在三個(gè)時(shí)間

9、點(diǎn)分別是100umol/L組的2.19倍，1.96倍和4.79倍。但是Fe(Ⅱ)和Fe(Ⅲ)對HASMC增殖的抑制作用并未表現(xiàn)出時(shí)間依賴性，在12小時(shí)時(shí)，抑制作用最強(qiáng)。
　　 二、Fe(Ⅱ)和Fe(Ⅲ)干預(yù)培養(yǎng)后HASMC增殖蛋白PCNA和凋亡蛋白P53表達(dá)的變化
　　 在Fe(Ⅱ)和Fe(Ⅲ)100umol/L,300umol/L和500umol/L三個(gè)濃度組，至24小時(shí)各組PCNA表達(dá)量均明顯減少，對照組無明顯改變。

10、與對照組相比，24小時(shí)PCNA在Fe(Ⅱ)組和Fe(Ⅲ)組的表達(dá)量均減少，且均隨著濃度的增加其減少更為明顯。PCNA在Fe(Ⅲ)組表達(dá)量低于Fe(Ⅱ)組。
　　 P53在各組中12小時(shí)比6小時(shí)表達(dá)量減少，至24小時(shí)表達(dá)量又增加，對照組卻有下降趨勢。與正常對照組相比，各時(shí)間點(diǎn)P53在Fe(Ⅱ)組和Fe(Ⅲ)組的表達(dá)量均增加，且均隨著濃度的增加而逐漸增加，24小時(shí)P53表達(dá)量較對照組增加最為明顯。P53在Fe(Ⅲ)組表達(dá)量高于Fe(

11、Ⅱ)組。
　　 結(jié)論：
　　 本研究表明，F(xiàn)e(Ⅱ)和Fe(Ⅲ)均有抑制HASMC增殖的作用，且呈濃度依賴性。其機(jī)制與Fe(Ⅱ)和Fe(Ⅲ)使HASMC增殖蛋白PCNA的表達(dá)減少和促凋亡蛋白P53的表達(dá)增加有關(guān)?？扇苄匀齼r(jià)鐵對HASMC增殖的抑制作用可能強(qiáng)于可溶性二價(jià)鐵。由于支架置入后平滑肌細(xì)胞過度增生是造成再狹窄的主要機(jī)制。鐵的上述特性對作為可降解支架的材料具有重要意義。
　　 第二部分：
　　 可降解

12、鐵支架在小型豬冠狀動(dòng)脈模型的初步研究
　　 金屬裸支架(BMS)置入術(shù)后仍有大約15-30%的患者出現(xiàn)再狹窄，藥物洗脫支架(DES)使支架內(nèi)再狹窄發(fā)生率顯著降至10%以內(nèi)。但與裸金屬支架相比，DES輕度但有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義地增加了晚期支架血栓的發(fā)生率，這可能與不可降解的涂層在局部造成持續(xù)炎癥反應(yīng)和過敏反應(yīng)有關(guān)。為避免不可降解的聚合物涂層永久殘留于血管壁中所引起的不利作用，進(jìn)一步避免永久殘留于血管壁中的金屬支架對血管壁的長期異物刺激，發(fā)

13、展全降解的DES使其在完成防止血管彈性回縮和釋放藥物的作用后從血管壁中被完全降解吸收，是新型DES發(fā)展的趨勢之一。鐵是安全的可降解金屬，有潛在可能成為可降解金屬支架材料，但目前關(guān)于鐵可降解支架的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)有限。
　　 目的：
　　 為產(chǎn)學(xué)研結(jié)合開發(fā)國產(chǎn)可降解鐵支架，本研究在健康小型豬冠狀動(dòng)脈模型觀察可降解滲氮鐵支架（先健公司，深圳）的生物安全性和對新生內(nèi)膜增生的影響，并與Vision鈷鉻合金支架進(jìn)行對比，初步探索鐵支架的可

14、行性。
　　 方法：
　　 8只鐵支架和8只Vision支架隨機(jī)分別置入8頭健康小型豬的冠狀動(dòng)脈前降支及右冠狀動(dòng)脈，每頭豬置入相同品牌支架。術(shù)后4周時(shí)將動(dòng)物處死，進(jìn)行組織病理學(xué)分析，測量支架處冠狀動(dòng)脈平均內(nèi)膜厚度、新生內(nèi)膜面積、面積狹窄百分比及形態(tài)學(xué)改變，免疫組化染色觀察細(xì)胞增殖蛋白PCNA表達(dá)；通過掃描電鏡(SEM)觀察內(nèi)皮愈合情況，通過OCT觀察支架桿覆蓋率；并觀察支架置入周圍組織、心、肝、脾、肺、腎及腦組織的形態(tài)學(xué)

15、改變及有無鐵沉積。
　　 結(jié)果：
　　 鐵組與Vision組相比,4周時(shí)平均內(nèi)膜厚度(0.46±0.17mm比0.45±0.18mm，P=0.878)、新生內(nèi)膜面積（2.55±0.91mm2比3.04±1.15mm2，P=0.360）和面積狹窄百分比（44.50±11.40%比46.00±17.95%，P=0.845）差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性；兩組均有2例重度狹窄；均未見血栓、炎癥及組織壞死征象兩組SEM評分(0.75±1.

16、04比0.88±0.99，P=0.809)和PCNA染色陽性(19.75±4.11%比23.25±4.86%,P=0.314)均無顯著性差異，鐵支架組的內(nèi)皮覆蓋內(nèi)膜百分比(84.38±14.50%比65.00±22.04%，P=0.057)有增高的趨勢，但未達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。OCT觀察兩組的最小管腔直徑（1.81±0.18mm比1.76±0.36mm，P=0.785）、最小管腔面積(3.34±0.56mm2比2.96±0.82mm2，P

17、=0.436)差別無顯著性；兩組支架桿覆蓋率均非常高(99.63±0.38%比99.66±0.68%，P=0.927)，無顯著性差異。鐵支架4周時(shí)已開始降解，鐵支架組的支架桿周圍組織可見鐵染色陽性，該區(qū)域未見炎性改變。兩組的脾臟的鐵染色為陽性，余臟器鐵染色為陰性，各臟器均未見異常組織學(xué)改變。
　　 結(jié)論：
　　 本研究結(jié)果顯示，鐵支架置入健康小型豬冠狀動(dòng)脈4周顯示良好的組織相容性和血液相容性。支架置入術(shù)后4周內(nèi)膜增生情況