Semaphorin 3A的促成骨分化作用在2型糖尿病大鼠種植體骨結合中的應用研究.pdf

1、種植義齒是目前最為理想的口腔缺牙修復方式，但由于骨結合不良，T2DM患者種植義齒的失敗率顯著高于健康缺牙患者。有研究表明T2DM種植體周圍成骨相關細胞的成骨分化能力受到抑制是骨結合不足的關鍵因素，因此，提高成骨相關細胞的成骨分化能力是解決T2DM骨結合不良的根本途徑。Sema3A是新發(fā)現(xiàn)的極具特色的骨保護因子，能夠同時有效的促進成骨分化和抑制破骨分化，可能是較為理想的提高種植體骨結合的分子。因此，本研究首先采用了殼聚糖薄膜作為載體將Se

2、ma3A負載到鈦種植體表面，體外觀察了其促進成骨分化的效應。
　　近些年來，由于ASCs具有來源廣泛、取材方便、傷害性小等優(yōu)勢，是極為理想的干細胞來源，而基于ASCs的膜片技術被認為是極富前景的組織修復技術，目前尚未見應用于種植體周圍的報道。與此同時，對于ASCs成骨分化能力目前尚存在諸多爭議，多數(shù)認為ASCs的骨基質(zhì)礦化作用和鈣沉積尚不能滿足T2DM患者種植修復的臨床需求，因此有必要提高ASCs的成骨能力以應用于種植體周圍。因此

3、，本研究隨后擬采用Sema3A修飾ASCs，檢測Sema3A對于ASCs形態(tài)、增殖及成骨能力的影響，并通過動物體內(nèi)實驗證實 Sema3A修飾的 ASCs膜片包裹到種植體周圍對T2DM大鼠種植體骨結合的作用。
　　第一部分、Sema3A修飾的種植體表面對成骨細胞成骨分化的促進作用
　　目的：觀察Sema3A修飾的種植體表面對成骨細胞行為的影響。
　　方法：鈦種植體采用MAO處理，利用硅烷偶聯(lián)劑將殼聚糖和Sema3A混合物

4、共價結合到MAO鈦種植體表面，根據(jù)種植體表面加載復合物的不同分為四組：CS/sema-MAO、CS/BSA-MAO、CS-MAO和MAO。將成骨細胞MG63直接接種到不同試樣表面，培養(yǎng)2小時后采用DAPI染色觀察細胞粘附數(shù)量；培養(yǎng)1、3、7天后采用MTT檢測細胞活力；成骨誘導3、7天后采用RT-qPCR檢測成骨相關基因RUNX2、ALP、OCN、BMP的表達；成骨誘導21天后采用茜素紅檢測礦化形成。
　　結果：經(jīng)Sema3A修飾后

5、的MAO種植體對成骨細胞粘附能力與對照組無顯著差別；在各個培養(yǎng)時間點對細胞活力無明顯影響；誘導3天后RUNX2表達提升3倍以上，其余基因表達提升了2倍以上，誘導7天后RUNX2無顯著提升，但其余基因表達提升到3倍以上；茜素紅染色顯示Sema3A修飾后的種植體能夠顯著促進成骨細胞礦化能力。
　　結論：Sema3A修飾的種植體表面能夠顯著提升成骨細胞的成骨分化能力。
　　第二部分、Sema3A對ASCs形態(tài)、增殖及成骨分化的影響

6、
　　目的：觀察Sema3A對ASCs形態(tài)、增殖及成骨分化的影響。
　　方法：調(diào)整Sema3A在培養(yǎng)液中的終濃度為0、0.25、0.5、1.0μg/ml，對應實驗的4個組：ASC組；ASC-0.25組；ASC-0.5組；ASC-1.0組。采用掃描電鏡觀察細胞形態(tài)變化；CCK-8法檢測細胞增殖活性；RT-qPCR技術檢測成骨相關基因表達的影響；ALP染色、天狼星紅染色、茜素紅染色觀察ALP活性、膠原分泌和礦化程度。
　　

7、結果：
　?。?）Sema3A對于 ASCs形態(tài)變化無明顯影響。
　?。?）Sema3A劑量的改變未對ASCs增殖能力產(chǎn)生影響。
　　（3）隨著Sema3A濃度的增加，成骨分化相關基因ALP、COL1等表達明顯升高。
　　（4）隨著Sema3A濃度的增加，ALP表達和膠原分泌增加；茜素紅染色可見Sema3A干預組鈣結節(jié)生成較空白ASCs組增加，但各個濃度之間差異不明顯。
　　結論：Sema3A對于ASCs形

8、態(tài)變化、增殖能力均影響不大，但能夠顯著增強ASCs的成骨分化能力，且Sema3A濃度的增加，促進作用也增強。
　　第三部分、Sema3A修飾的ASCs膜片對T2DM大鼠種植體骨結合的作用
　　目的：觀察Sema3A修飾后的ASCs膜片對于T2DM種植體骨結合的影響。
　　方法：高脂高糖飼料喂養(yǎng)+小劑量STZ腹腔注射誘導T2DM大鼠，采用含不同濃度Sema3A（0、0.25、0.5、1.0μg/ml）的成膜誘導液培養(yǎng)誘導

9、ASCs形成膜片并包裹種植體形成膜片-種植體復合物，將膜片-種植體復合物植入T2DM大鼠脛骨近骺端，4周、8周后取材分別行Micro-CT掃描及Van Gieson染色分析。
　　結果：誘導成功的T2DM大鼠隨機血糖較穩(wěn)定，且均>16.7mmol/l；倒置光學顯微鏡下可見膜片誘導成功，刮取后回縮成球形，能很好的包裹種植體；Micro-CT掃描結果可見，隨Sema3A濃度的增加，種植體周圍新骨形成增加；組織染色可見Sema3A修飾的