TTRAP影響腫瘤細(xì)胞生長和依托泊苷藥物敏感性的分子機(jī)理初步研究.pdf

1、DNA損傷修復(fù)與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，其中的關(guān)鍵分子和信號(hào)通路是抗腫瘤藥物研究和開發(fā)的重要靶點(diǎn)。TTRAP(TRAF and TNF receptor-associatedprotein)是一個(gè)新鑒定的5'-酪氨酰DNA磷酸二酯酶，在細(xì)胞發(fā)生DNA損傷時(shí)，可將雙鏈斷裂缺口處5'端的磷酯酪氨酰鍵水解轉(zhuǎn)化為5'磷酸，促進(jìn)DNA雙鏈斷裂修復(fù)。本論文旨在研究TTRAP對(duì)腫瘤細(xì)胞生長和化療藥物敏感性的影響，探討其能否作為腫瘤輔助治療的靶標(biāo)。<

2、br>　　為確定TTRAP是否與腫瘤發(fā)生有關(guān)，我們檢索了TTRAP在基因表達(dá)綜合庫中的數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)在早期發(fā)病的結(jié)直腸癌患者結(jié)腸黏膜和惡性轉(zhuǎn)化的前列腺癌患者腫瘤內(nèi)TTRAP表達(dá)量均較低。檢測肺癌、乳腺癌、前列腺癌及骨肉瘤等多種腫瘤細(xì)胞株的TTRAP蛋白表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)TTRAP在所有細(xì)胞中普遍存在，但其表達(dá)形式和表達(dá)豐度在各細(xì)胞株中存在較大差異。
　　在內(nèi)源TTRAP表達(dá)量相對(duì)較低的人骨肉瘤細(xì)胞株U2OS中，過表達(dá)野生型TTRAP(TTR

3、AP wild type，TTRAPwt)顯著抑制U2OS細(xì)胞的克隆形成。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染TTRAP的細(xì)胞株在持續(xù)6天的生長曲線中顯示生長變緩。表達(dá)TTRAP酶活性的無功能突變體TTRAP(E152A)及TTRAP(D262A)可部分緩解這種抑制作用。TTRAPwt的過表達(dá)對(duì)NF-κ B的轉(zhuǎn)錄活性有抑制作用，該作用可被突變體TTRAP(E152A)及TTRAP(D262A)的表達(dá)所抵消。TTRAP也可抑制U2OS細(xì)胞遷移，但TTRAP酶活性的突

4、變對(duì)這一作用沒有影響。上述結(jié)果提示TTRAP對(duì)腫瘤細(xì)胞有生長抑制作用，這種抑制作用依賴于其5，-酪氨酰DNA磷酸二酯酶活性，可能與NF-κ B信號(hào)通路相關(guān)。
　　TP53是DNA損傷反應(yīng)中決定細(xì)胞命運(yùn)的關(guān)鍵蛋白。為探討TTRAP影響腫瘤細(xì)胞生長的分子機(jī)制，我們應(yīng)用酵母雙雜交鑒定了TTRAP與TP53的直接相互作用。TP53的截短突變體與TTRAP的酵母配對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，TP53的DNA結(jié)合域與兩者間的相互作用有關(guān)。免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)證

5、實(shí)293T細(xì)胞內(nèi)源表達(dá)的TP53和TTRAP存在相互作用。熒光蛋白融合體EGFP-p53和TTRAP-DsRed可共定位于細(xì)胞核內(nèi)，表明TTRAP和TP53在空間上存在相互作用的可能。應(yīng)用螢光素酶報(bào)告基因檢測TP53對(duì)下游靶基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用，在低水平表達(dá)TP53的情況下，TTRAP促進(jìn)TP53對(duì)下游基因的轉(zhuǎn)錄激活作用。
　　依托泊苷是臨床常用的抗腫瘤藥物，通過干擾拓?fù)洚悩?gòu)酶2(topisomerase2，Top2)介導(dǎo)的DNA再

6、連接反應(yīng)使DNA雙鏈斷裂。體外藥物敏感性研究表明，U2OS細(xì)胞過表達(dá)TTRAPwt后，依托泊苷處理使其克隆存活率顯著高于空載體對(duì)照;細(xì)胞內(nèi)源TTRAP用siRNA沉默表達(dá)，藥物處理后的克隆存活率低于對(duì)照。在細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)中，U2OS細(xì)胞過表達(dá)TTRAPwt后對(duì)依托泊苷的細(xì)胞毒效應(yīng)低于空載體對(duì)照，而過表達(dá)TTRAP(E152A)和TTRAP(D262A)后其效應(yīng)高于對(duì)照。這表明TTRAP的表達(dá)量與U2OS細(xì)胞對(duì)依托泊苷的藥物敏感性呈負(fù)相關(guān)。

7、
　　為進(jìn)一步探討TTRAP與依托泊苷細(xì)胞殺傷效應(yīng)的相關(guān)性，我們檢測了藥物處理情況下TTRAP轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化，發(fā)現(xiàn)依托泊苷處理1～6小時(shí)內(nèi)TTRAP的轉(zhuǎn)錄沒有顯著提高，但其蛋白量有所增加。以亞胺環(huán)己酮(cycloheximide，CHX)抑制細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)合成時(shí)，TTRAP的蛋白表達(dá)量在1～9小時(shí)內(nèi)逐漸減少，而同時(shí)加CHX和依托泊苷處理，細(xì)胞內(nèi)TTRAP蛋白降解速度減緩，表明依托泊苷處理提高了TTRAP蛋白的穩(wěn)定性，減緩了

8、蛋白的降解過程。因翻譯后修飾（post-translational modifications，PTM），如泛素化和SOMO化情況的變化會(huì)影響蛋白穩(wěn)定性，依托泊苷對(duì)TTRAP蛋白穩(wěn)定性的影響可能涉及蛋白的泛素化抑制和SOMO化激活，其具體機(jī)理還需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。SUMO非共價(jià)結(jié)合也屬于蛋白翻譯后修飾的一種。將TTRAP基因中的SUMO蛋白非共價(jià)結(jié)合位點(diǎn)突變后與紅熒光基因融合后構(gòu)建成融合蛋白表達(dá)質(zhì)粒pTTRAP(SIMm)-DsRed，

9、該質(zhì)粒在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)量顯著下降，且不再呈現(xiàn)PML核體典型的點(diǎn)狀分布特征，說明SUMO蛋白的結(jié)合對(duì)TTRAP蛋白在細(xì)胞內(nèi)的穩(wěn)定表達(dá)和亞細(xì)胞定位起著重要作用。
　　綜上所述，本論文發(fā)現(xiàn)了TTRAP對(duì)U2OS腫瘤細(xì)胞的生長有抑制作用，U2OS細(xì)胞對(duì)抗腫瘤藥物依托泊苷的敏感性與TTRAP的表達(dá)量呈負(fù)有關(guān)。上述結(jié)果表明對(duì)TTRAP表達(dá)和活性的調(diào)節(jié)有助于改善腫瘤細(xì)胞對(duì)依托泊苷的藥物敏感性，為TTRAP應(yīng)用于腫瘤的輔助治療提供了初步的實(shí)驗(yàn)和理論