EETs和滲透壓對大鼠內(nèi)髓集合管細(xì)胞γ-ENaC調(diào)控機(jī)制的研究.pdf

1、流行病學(xué)調(diào)查及實(shí)驗(yàn)研究表明，鹽作為重要的環(huán)境因素與高血壓的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。20世紀(jì)70年代末Kawasaki和Luft提出了“血壓的鹽敏感性(salt—sensitive)”概念，定義為：相對高鹽攝入所引起的血壓升高。鹽敏感性者細(xì)胞膜Na+轉(zhuǎn)運(yùn)缺陷是其主要發(fā)生機(jī)制，高鹽攝入直接導(dǎo)致鈉潴留，引起血容量過負(fù)荷，從而導(dǎo)致血壓升高。水鈉潴留是引起高血壓的重要機(jī)制，一直深受國內(nèi)外學(xué)者關(guān)注，從腎小管離子通道去探討高血壓的鹽敏感性發(fā)生機(jī)制近年來取得

2、了長足進(jìn)展。 上皮鈉通道(Epithelial sodium channel，ENaC)是非電壓門控的阿米洛利敏感性異側(cè)離子通道，廣泛存在于多個組織器官，對Na+有高度特異性，可使Na+通過下調(diào)自身電化學(xué)梯度進(jìn)入細(xì)胞。功能性表達(dá)及生化資料顯示，ENaC是一種跨膜蛋白，有3個同源的亞單位：α、β和γ—ENaC。大量研究證實(shí)，γ—ENaC是腎臟ENaC發(fā)揮主要調(diào)節(jié)作用的亞單位。 內(nèi)髓集合管(Inner medullary c

3、ollecting duct，IMCD)是哺乳動物集合管的終末部位，為控制Na+排泄的最后節(jié)段。IMCD中直接參與滲透平衡和酸堿平衡調(diào)節(jié)的是IMCD細(xì)胞。ENaC在腎臟主要分布在遠(yuǎn)曲小管和集合管，而IMCD管腔側(cè)ENaC在維持機(jī)體對Na+的重吸收、體液平衡及血壓調(diào)節(jié)中起著關(guān)鍵作用。臨床和基礎(chǔ)研究均發(fā)現(xiàn)，IMCD中ENaC活性增加導(dǎo)致的水鈉潴留是高血壓鹽敏感性發(fā)生機(jī)制的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。已經(jīng)證實(shí)ENaC基因變異可導(dǎo)致遺傳性高血壓或低血壓。盡管目前

4、ENaC的調(diào)控機(jī)制尚不清楚，尋找IMCD中ENaC的調(diào)控因子一直是本領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。 EETs(環(huán)氧二十碳烯酸，Epoxyeicosatrienoic acids)是花生四烯酸(arachidonic acid，AA)主要通過細(xì)胞色素P—450(cytochrome P—450，簡稱CYP)表氧化反應(yīng)生成的產(chǎn)物，包括5，6-，8，9-，11，12-和14，15-EET。CYP2C23是大鼠腎臟CYP主要亞型。EETs可以直接擴(kuò)

5、張血管因而具有很強(qiáng)的調(diào)控血壓效應(yīng)，被認(rèn)為是內(nèi)皮源性超極化因子(endothelium—derived hyperpolarizing factors，EDHFs)，其擴(kuò)血管效應(yīng)在高血壓的病理生理作用已得到肯定。近年研究還發(fā)現(xiàn)EETs對多種離子通道，包括Na+通道具有調(diào)控效應(yīng)。已經(jīng)證實(shí)EETs可以通過在腎臟促進(jìn)尿鈉排泄而達(dá)到調(diào)控血壓效應(yīng)，而這一效應(yīng)是通過調(diào)節(jié)腎臟集合管ENaC轉(zhuǎn)運(yùn)能力來實(shí)現(xiàn)的。EETs對ENaC活性的調(diào)控作用是當(dāng)前研究熱點(diǎn)

6、，但國內(nèi)相關(guān)研究甚少。 此外IMCD處于全身滲透壓變化跨度最大的腎臟內(nèi)髓組織，其中Na+是構(gòu)成滲透壓的重要因素。ENaC活性改變會直接影響細(xì)胞膜兩側(cè)Na+濃度，有研究表明ENaC可能受細(xì)胞內(nèi)Na+反饋性調(diào)節(jié)；IMCD細(xì)胞中ENaC的存在已經(jīng)被證實(shí)，但細(xì)胞外Na+對IMCD細(xì)胞ENaC表達(dá)是否有影響，國內(nèi)外報道甚少。以往對ENaC的研究大都建立在動物模型基礎(chǔ)上，或采用微穿刺和微灌注等方法來探討EETs對腎臟ENaC活性的調(diào)控作用；

7、但由于腎小管的不同節(jié)段對鈉離子的調(diào)控作用不同，且涉及多種離子通道；既往研究大多集中在皮質(zhì)腎小管，而相關(guān)的體外研究EETs對IMCD細(xì)胞ENaC活性的調(diào)控作用國內(nèi)外還尚屬空白，因此本實(shí)驗(yàn)旨在探討EETs和不同氯化鈉滲透壓環(huán)境對體外培養(yǎng)的原代IMCD細(xì)胞ENaC的調(diào)控作用。 第1章不同滲透壓環(huán)境對IMCD細(xì)胞增殖活性和ENaC表達(dá)的影響 研究目的：探討不同滲透壓環(huán)境對大鼠IMCD細(xì)胞增殖活性和ENaC表達(dá)的影響。 材

8、料與方法： 1.采用膠原酶消化和低滲溶解法分離培養(yǎng)雄性SD大鼠原代IMCD細(xì)胞，予含10％胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基，置于37℃、5％CO2的恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。所有實(shí)驗(yàn)均取第二代對數(shù)生長期細(xì)胞。用免疫熒光技術(shù)檢測IMCD細(xì)胞中α、β和γ—ENaC的表達(dá)部位。 2.模擬IMCD細(xì)胞的體內(nèi)環(huán)境，通過增加細(xì)胞外液中Na+濃度造成高滲環(huán)境，降低Na+濃度造成低滲環(huán)境。IMCD細(xì)胞在正常培養(yǎng)基中生長72h(融合至80％以上)

9、后，分為三組，分別更換培養(yǎng)基為低滲培養(yǎng)基(200mOsmol/kgH2O，等滲培養(yǎng)基+純水)，等滲培養(yǎng)基(300mOsmol/kgH2O，普通DMEM/F12培養(yǎng)液)或高滲培養(yǎng)基(600mOsmol/kgH2O，等滲培養(yǎng)基+9％NaCl)；三種培養(yǎng)基胎牛血清終濃度均為10％。在12h和24h分別應(yīng)用MTT法(噻唑藍(lán))檢測活細(xì)胞數(shù)目、流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期和凋亡率，評價IMCD細(xì)胞的滲透壓耐受性，并分別收集各組細(xì)胞蛋白用Western B

10、lot法(免疫印跡法，簡稱WB法)半定量檢測β—ENaC和γ—ENaC的表達(dá)水平。WB結(jié)果用凝膠圖象處理系統(tǒng)Quantity One4.4.0對膠片進(jìn)行掃描測量感光區(qū)帶的感光密度，并進(jìn)行積分處理。 結(jié)論： 1.高滲環(huán)境可以抑制IMCD細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)其凋亡，12h作用較顯著；而24h時低滲環(huán)境對IMCD細(xì)胞的抑制增殖和誘導(dǎo)凋亡效應(yīng)增加； 2.細(xì)胞外氯化鈉滲透壓的改變不能調(diào)控IMCD細(xì)胞ENaC表達(dá)。 第2章

11、 EETs對IMCD細(xì)胞ENaC表達(dá)的調(diào)控作用 研究目的：探討外源性11，12-EET和CYP2C23-EGFP重組腺病毒轉(zhuǎn)染對大鼠IMCD細(xì)胞γ-ENaC表達(dá)的影響，旨在為EETs調(diào)節(jié)機(jī)體水鈉負(fù)荷和血壓鹽敏感性提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和理淪依據(jù)。 材料與方法： SD大鼠原代IMCD細(xì)胞培養(yǎng)：參見第1章。 外源性11，12-EET：購自美國sigma公司，100ug/ml，純度：98％。 CYP2C23-

12、EGFP重組腺病毒：1×1012VP/ml，大鼠源性的CYP2C23-pBluescript SK+/-，由QBIOgene公司完成克隆載體CYP2C23-IRES2-EGFP的構(gòu)建、鑒定，以及感染HEK293細(xì)胞后擴(kuò)增、CsC1密度梯度超速離心純化。 1.外源性11，12-EET干預(yù)實(shí)驗(yàn)：將IMCD細(xì)胞按1.0×106cell/孔接種于6孔板中，在正常培養(yǎng)基中培養(yǎng)至融合80％以上后使用，設(shè)實(shí)驗(yàn)組(三組，11，12-E

13、ET不同濃度)和空白對照組(正常培養(yǎng)基)，實(shí)驗(yàn)組按終濃度為10ng/ml、100ng/ml與1000ng/ml分別更換為5ml含有11，12-EET的DMEM/F12培養(yǎng)基，各組培養(yǎng)基中胎牛血清終濃度均為10％，并繼續(xù)置于37℃、5％CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。在12h和24h分別收集細(xì)胞蛋白，WB法半定量檢測各組β-ENaC和γ-ENaC的表達(dá)水平。 2.CYP2C23-EGFP重組腺病毒轉(zhuǎn)染IMCD細(xì)胞實(shí)驗(yàn)：將IMCD細(xì)胞按1.0×

14、106 cell/孔接種于6孔板中，培養(yǎng)至60％-70％左右融合時使用，設(shè)實(shí)驗(yàn)組(三組，CYP2C23-EGFP不同轉(zhuǎn)染滴度)和對照組(高滴度對照腺病毒：購自QBIOgene公司，不含有CYP2C23和EGFP)，實(shí)驗(yàn)組按0.4×109、2.0×109與4.0×109的病毒顆粒分別加入5ml含有CYP2C23-EGFP重組腺病毒的DMEM/F12培養(yǎng)基，對照組加入5ml含對照腺病毒顆粒4.0×109的DMEM/F12培養(yǎng)基，各組培養(yǎng)基中

15、胎牛血清終濃度均為5％，并繼續(xù)置于37℃、5％CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。在12h和24h，熒光倒置顯微鏡下觀察CYP2C23-EGFP重組腺病毒轉(zhuǎn)染IMCD細(xì)胞后的熒光表達(dá)強(qiáng)度，熒光強(qiáng)度平均積分光密度使用Image-Pro Plus6.0軟件定量分析。病毒轉(zhuǎn)染滴度與轉(zhuǎn)染細(xì)胞熒光表達(dá)強(qiáng)度的相關(guān)性分析采用Spearman等級相關(guān)。高倍鏡下計(jì)算各組病毒體外轉(zhuǎn)染率，并分別收集各組細(xì)胞蛋白，WB法半定量檢測各組γ-ENaC的表達(dá)水平。 結(jié)論：