人結(jié)石腎內(nèi)髓集合管細(xì)胞的原代培養(yǎng).pdf

1、研究背景:尿石癥是最常見(jiàn)的泌尿系統(tǒng)良性疾病之一。據(jù)研究資料顯示，在發(fā)達(dá)國(guó)家中，美國(guó)上尿路結(jié)石的發(fā)病率為13％，加拿大為12％，歐洲為5-9％，日本為10％，其中60％的患者為草酸鈣結(jié)石。流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)男性結(jié)石的發(fā)病率約為女性的三倍。我國(guó)更是世界上尿路結(jié)石三大高發(fā)區(qū)之一。近年來(lái)我國(guó)泌尿系結(jié)石的發(fā)病率為1-5％，而南方則高達(dá)5-10％，年新發(fā)病率120-6020/10萬(wàn)人。不僅如此，結(jié)石的復(fù)發(fā)率也相當(dāng)高，排石或取石治療后，7-8年內(nèi)的復(fù)發(fā)

2、率約為50-70％。如此高的發(fā)病率和復(fù)發(fā)率使得尿石癥成為了一個(gè)嚴(yán)重的社會(huì)問(wèn)題。然而結(jié)石的發(fā)病機(jī)制仍然不明，沒(méi)有有效的手段預(yù)防結(jié)石的發(fā)生和治療后的復(fù)發(fā)。目前研究認(rèn)為結(jié)石發(fā)生發(fā)展主要的可能的影響因素包括環(huán)境、代謝及基因等方面。髓質(zhì)海綿腎是以內(nèi)髓集合管(IMCD)囊狀擴(kuò)張為特點(diǎn)的一種疾病，并且大部分患者伴有腎多發(fā)結(jié)石及腎小管酸中毒。內(nèi)髓集合管(IMCD)作為腎小管的最后一段，位于腎髓質(zhì)錐體內(nèi)，IMCD細(xì)胞直接參與滲透平衡和酸堿平衡調(diào)節(jié)。但國(guó)內(nèi)

3、迄今尚未見(jiàn)有人類(lèi)腎IMCD細(xì)胞培養(yǎng)的研究報(bào)告。因此，我們嘗試進(jìn)行人結(jié)石腎臟IMCD細(xì)胞分離、培養(yǎng)。
　　 目的:通過(guò)對(duì)正常腎臟及腎結(jié)石患者腎臟內(nèi)髓集合管細(xì)胞的培養(yǎng)，建立人結(jié)石腎內(nèi)髓集合管細(xì)胞的分離、原代培養(yǎng)及鑒定方法，為進(jìn)一步研究腎結(jié)石及海綿腎的發(fā)病機(jī)制奠定基礎(chǔ)。
　　 方法:選取腎癌根治術(shù)及腎結(jié)石與海綿腎行PCNL手術(shù)的患者納入研究。在術(shù)后B超定位下穿刺腎錐體，取出兩條目標(biāo)組織，放入裝有無(wú)菌生理鹽水的凍存管中，并低溫迅

4、速運(yùn)送至實(shí)驗(yàn)室。在超凈臺(tái)上，將組織吸出放入培養(yǎng)皿中，吸去多余生理鹽水，加入含有膠原酶Ⅳ、透明質(zhì)酸酶、DnaseⅠ及抗生素混合的DMEM/F12消化液4ml，將組織剪碎至長(zhǎng)度1mm左右后，放入15ml離心管中，室溫，持續(xù)輕微搖晃消化8小時(shí)。消化好的細(xì)胞懸液經(jīng)BDFALCON100um細(xì)胞濾網(wǎng)過(guò)濾，并研磨未完全消化的組織，使其通過(guò)濾網(wǎng)。濾液在室溫下400g離心8min，去上清液。用無(wú)菌PBS洗滌后，再次在室溫下400g離心8min，重復(fù)2次

5、。所剩細(xì)胞沉淀加入8ml含有10％小牛血清及抗生素的DMEM/F12培養(yǎng)液，分別加入6孔培養(yǎng)板的其中2孔中。同時(shí)取3滴細(xì)胞懸液加入另一試管，加入0.4％臺(tái)盼藍(lán)1滴染色3min，以細(xì)胞核拒染作為細(xì)胞良好的依據(jù)。培養(yǎng)板放于37℃、5％CO2環(huán)境中靜置培養(yǎng)3天，第四天取出，用無(wú)菌PBS洗去未貼壁細(xì)胞，更換培養(yǎng)液，以后每3天更換一次。于接種后12天加入D-纈氨酸修飾的MEM培養(yǎng)基(含有10％小牛血清及1:50青鏈霉素)來(lái)抑制成纖維細(xì)胞的生長(zhǎng)。穩(wěn)